Tradiční diagnostické strategie pro detekci infekčních onemocnění vyžadují použití stolních přístrojů, které nejsou vhodné pro testování v místě péče (POCT).Vznikající mikrofluidika je vysoce miniaturizovaná, automatizovaná a integrovaná technologie, která je potenciální alternativou k tradičním metodám pro rychlou, levnou a přesnou diagnostiku na místě.Molekulární diagnostické metody jsou široce používány v mikrofluidních zařízeních jako nejúčinnější metody pro detekci patogenů.Tento přehled shrnuje nedávné pokroky v mikrofluidní molekulární diagnostice infekčních onemocnění z akademické i průmyslové perspektivy.Nejprve popíšeme typické zpracování nukleových kyselin na čipu, včetně předúpravy vzorku, amplifikace a čtení signálu.Poté jsou porovnány vlastnosti, výhody a nevýhody čtyř typů mikrofluidních platforem.Dále probereme použití digitálních testů pro absolutní kvantifikaci nukleových kyselin.Klasické i současné komerční molekulární diagnostické přístroje na mikrofluidní bázi jsou shrnuty jako důkaz současného stavu trhu.Nakonec navrhujeme budoucí směry pro mikrofluidní diagnostiku infekčních onemocnění.
Infekční onemocnění jsou způsobena patogeny, včetně bakterií, virů a parazitů, které jsou rozšířeny po celém světě.Na rozdíl od jiných nemocí se patogeny rychle infikují a šíří mezi lidmi a hostitelskými zvířaty prostřednictvím očkování, vzduchu a vody [1].Prevence infekčních chorob je jako opatření veřejného zdraví zásadní.Tři hlavní strategie pro boj s infekčními nemocemi: (1) kontrola zdroje infekce;(2) přerušení přenosové cesty;(3) ochrana vnímavých populací.Mezi hlavními strategiemi je kontrola zdroje infekce považována za nejdůležitější strategii díky své výhodnosti a nízké ceně.Rychlá diagnostika, izolace a léčba infikovaných jedinců jsou zásadní a vyžadují rychlé, citlivé a přesné diagnostické strategie [2].Současná diagnostika infekčních onemocnění obvykle kombinuje klinické vyšetření založené na příznacích a symptomech a laboratorní studie, jako je buněčná kultura a molekulární diagnostika, které vyžadují vyškolený personál, pracné postupy a drahé testovací vybavení [3, 4].Prevence propuknutí infekčních chorob vyžaduje rychlou, nenákladnou a přesnou místní diagnostiku, zejména v oblastech s omezenými zdroji, kde jsou infekční choroby běžné a závažné [5], a také léčbu v divočině nebo na bojišti, kde jsou mimořádné události nepředvídatelné..lékařská péče je omezená [6].V tomto kontextu je mikrofluidika technologií, která kombinuje technologie mikroelektromechanických systémů, nanotechnologie nebo vědu o materiálech pro přesnou manipulaci s tekutinami [7,8,9,10] a poskytuje nové možnosti pro detekci v místě péče (POCT).) infekční agens mimo nemocnice a laboratoře.Ve srovnání s tradiční časově náročnou diagnostikou nabízí mikrofluidní technologie úspory vzorků a nákladů na molekulární diagnostiku během propuknutí onemocnění.Globální šíření koronavirové nemoci 2019 (COVID-19) je způsobeno těžkým akutním respiračním syndromem coronavirus 2 (SARS-CoV-2), proto je opět zdůrazněn význam mikrofluidiky pro včasnou prevenci a kontrolu pandemie [11, 12 , 13].Na rozdíl od tradiční diagnostiky používá mikrofluidní POCT malá přenosná zařízení od stolních analyzátorů až po malé testovací proužky s bočním proudem k testování v blízkosti místa odběru vzorků [14].Tyto testy se vyznačují jednoduchou nebo žádnou přípravou vzorku, rychlým zesílením signálu a citlivými odečty signálu, jejichž výsledkem je krátké trvání a přesné výsledky během několika minut.Dostupnost a masová výroba zdravotnických přístrojů na bázi mikrofluidů rozšířila jejich nákladově efektivní a přímé diagnostické aplikace mimo nemocnici, v blízkosti pacienta a dokonce i doma.
Mezi existujícími strategiemi diagnostiky infekčních onemocnění je molekulární diagnostika jednou z nejcitlivějších [15, 16].Molekulární diagnostika se navíc často používá jako zlatý standard pro kontinuální detekci COVID-19, který umožňuje přímou detekci virově specifických oblastí RNA nebo DNA před nástupem imunitní odpovědi [17, 18].V aktuálním přehledu představujeme nejnovější pokroky v molekulárních diagnostických procesech infekčních onemocnění na bázi mikrofluidiky, od akademického pohledu až po budoucí průmyslové perspektivy (obr. 1).Začneme třemi klíčovými kroky v detekci nukleové kyseliny: předúprava vzorku na čipu, amplifikace nukleové kyseliny a čtení signálu.Poté jsme porovnali různé typy mikrofluidních platforem s jejich strukturou a funkcí, které vykazují jedinečné vlastnosti (silné a slabé stránky).Digitální detekce nukleových kyselin je dále diskutována a uvedena jako příklad technologie třetí generace pro absolutní kvantifikaci molekul infekčních patogenů.Kromě toho bude představeno několik typických a nejnovějších komerčních přístrojů POCT, které demonstrují současný stav trhu s mikrofluidními POCT pro molekulární diagnostiku.Budeme také diskutovat a vysvětlovat naši vizi budoucích aplikací.
Moduly mikrofluidních čipů pro detekci nukleových kyselin lze podle jejich funkcí rozdělit do tří kategorií (vzorkování, rozpoznávání a signalizace) [19].Mezi těmito moduly modul odběru vzorků realizuje především lýzu vzorku a extrakci nukleové kyseliny.Senzorový modul řídí především konverzi a amplifikaci signálů nukleových kyselin.Signalizační modul detekuje signál převedený a zpracovaný snímacím modulem.Na základě procesu detekce nukleových kyselin na čipu shrneme různé čipy, které mohou realizovat funkci „vstup a výstup“.
Prvním krokem detekce nukleové kyseliny je extrakce nukleové kyseliny, tj. izolace cílové nukleové kyseliny z původního vzorku.Extrakce nukleových kyselin se provádí za účelem čištění nukleových kyselin od jiných molekulárních kontaminantů, zajištění integrity primární struktury molekul nukleové kyseliny a optimalizace výsledků.Extrakce nukleových kyselin vyžaduje nezbytnou lýzu vzorku a zachycení nukleové kyseliny, jejichž kvalita a účinnost má obrovský vliv na výsledky výzkumu a diagnostiky.Jakékoli jemné vedlejší účinky během extrakce mohou omezit další detekci.Například metody polymerázové řetězové reakce (PCR) a smyčkové izotermické amplifikace (LAMP) jsou inhibovány některými zbytkovými organickými rozpouštědly, jako je ethanol a isopropanol v činidlech pro izolaci nukleových kyselin [20].Extrakce kapalina-kapalina a extrakce v pevné fázi jsou nejoblíbenějšími metodami pro izolaci nukleových kyselin [21], avšak extrakce kapalina-kapalina na čipu je extrémně omezená, protože činidla používaná při extrakci kapalina-kapalina způsobují korozi většiny mikrofluidních čipů. .Zde zdůrazňujeme metody extrakce na pevné fázi na bázi mikročipů a porovnáváme jejich výhody a nevýhody.
Křemík je substrátový materiál kompatibilní s nukleovými kyselinami díky své biokompatibilitě, stabilitě a snadné modifikaci [22].Důležité je, že když je tento kompozit modifikován oxidem křemičitým nebo jinými materiály, vykazuje vlastnosti adsorbovat záporně nabité nukleové kyseliny za podmínek s nízkým pH a vysokým obsahem soli, přičemž se eluuje roztoky s vysokým pH a nízkým obsahem soli.Na základě tohoto jevu je možné purifikovat nukleovou kyselinu.
Pro extrakci nukleových kyselin v mikrofluidikách byly použity různé formy materiálů na bázi oxidu křemičitého, jako jsou kuličky oxidu křemičitého, prášky, filtry z mikrovláken a membrány oxidu křemičitého [23, 24, 25, 26].V závislosti na vlastnostech materiálu lze materiály na bázi křemíku použít v mikroobvodech různými způsoby.Například granule oxidu křemičitého, prášky a komerční nanofiltry lze jednoduše umístit do pórů nebo mikrokanálů mikrofluidních čipů a pomoci extrahovat nukleové kyseliny ze vzorků [27, 28, 29].Povrchově modifikované křemičité membrány lze také použít k rychlému čištění DNA od patogenů za nízkou cenu.Například Wang a kol.[30] Kombinací denaturačních amplifikačních reakcí s výměnou řetězce zprostředkovanou vezikulami s křemičitými membránami potaženými chitosanovými oligosacharidy byl představen všestranný přenosný systém, který úspěšně detekoval 102–108 jednotek tvořících kolonie.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus.a přítomnost viru byla snadno viditelná.Powell a kol.[31] K detekci viru hepatitidy C (HCV), viru lidské imunodeficience (HIV), viru Zika a lidského papilomaviru a automatickému množení pak byly použity mikročipy na bázi křemíku, ve kterých byl vyvinut klikatý mikroreaktor o objemu 1,3 μl pro zachycení RNA virů.a provést amplifikaci in situ.Kromě těchto metod hrají klíčovou roli při extrakci nukleových kyselin také povrchově modifikované mikrokolony oxidu křemičitého, protože geometrie a vlastnosti modifikujícího materiálu značně zvyšují účinnost extrakce.Chen a kol.[32] navrhli mikrofluidní platformu pro izolaci RNA s nízkou koncentrací na bázi křemíkových mikrokolon potažených aminoskupinou.Toto mikrofluidní zařízení integruje pole 0,25 cm2 mikropilířů na křemíkovém substrátu pro dosažení vyšší účinnosti extrakce díky designu s vysokým poměrem plochy povrchu k objemu.Výhodou této konstrukce je, že mikrofluidní zařízení může dosáhnout až 95% účinnosti extrakce nukleových kyselin.Tyto strategie na bázi křemíku demonstrují hodnotu rychlé izolace nukleových kyselin za nízkou cenu.V kombinaci s mikrofluidními čipy mohou extrakční strategie na bázi křemíku nejen zvýšit účinnost detekce nukleových kyselin, ale také usnadnit miniaturizaci a integraci analytických zařízení [20].
Metody magnetické separace využívají magnetické částice k izolaci nukleových kyselin v přítomnosti vnějšího magnetického pole.Mezi běžně používané magnetické částice patří magnetické částice Fe3O4 nebo γ-Fe2O3 potažené oxidem křemičitým, aminoskupinou a karboxylem [33,34,35,36].Charakteristickým rysem magnetických částic ve srovnání s metodami SPE na bázi křemíku je snadná manipulace a ovládání pomocí externích magnetů.
Pomocí elektrostatické interakce mezi nukleovými kyselinami a oxidem křemičitým, za podmínek vysoké soli a nízkého pH, jsou nukleové kyseliny adsorbovány na povrchu magnetických částic potažených oxidem křemičitým, zatímco za podmínek nízké soli a vysokého pH mohou být molekuly promyty znovu..Magnetické kuličky potažené oxidem křemičitým umožňují extrahovat DNA z velkých objemů vzorků (400 μl) pomocí magneticky řízeného pohybu [37].Jako demonstraci Rodriguez-Mateos a kol.[38] používali laditelné magnety k řízení přenosu magnetických kuliček do různých komor.Na základě magnetických částic potažených oxidem křemičitým lze ze vzorků odpadní vody extrahovat 470 kopií/ml genomové RNA SARS-CoV-2 pro detekci reverzní transkripce LAMP (RT-LAMP) a odezvu lze odečíst do 1 hodiny.pouhým okem (obr. 2a).
Zařízení na bázi magnetických a porézních materiálů.Koncepční schéma mikrofluidního zařízení IFAST RT-LAMP pro detekci SARS-CoV-2 RNA (upraveno z [38]).b Odstředivé mikrozařízení pro dSPE nukleové kyseliny bukálního výtěru (upraveno podle [39]).c Vestavěný koncentrátor vzorků s vlastním napájením využívající kartu FTA® (upraveno podle [50]).d Filtrační papír Fusion 5 modifikovaný chitosanem (převzato z [51]).SARS-CoV-2 těžký akutní respirační syndrom koronavirus 2, izotermická amplifikace zprostředkovaná reverzní transkripční smyčkou RT-LAMP, technologičtí partneři FTA finders, nukleová kyselina NA
Pozitivně nabité magnetické částice jsou ideální pro připojení fosfátového hlavního řetězce nukleové kyseliny.Při určité koncentraci soli mohou být záporně nabité fosfátové skupiny nukleových kyselin nabity kladně na povrchu magnetických kompozitních částic.Pro extrakci nukleových kyselin byly proto vyvinuty magnetické nanočástice s drsným povrchem a vysokou hustotou aminoskupin.Po magnetické separaci a blokování mohou být magnetické nanočástice a komplexy DNA přímo použity v PCR, což eliminuje potřebu složitých a časově náročných purifikačních a elučních operací [35].Magnetické nanočástice potažené negativními karboxylovými skupinami byly také použity k separaci nukleových kyselin adsorbovaných na površích ve vysokých koncentracích roztoků polyethylenglykolu a chloridu sodného [36].S těmito povrchově upravenými magnetickými kuličkami je extrakce DNA kompatibilní s následnou amplifikací.Dignan a kol.[39] popsali automatizovanou a přenosnou odstředivou mikrofluidní platformu pro předúpravu nukleových kyselin, která umožňuje její použití na místě netechnickému personálu.Kromě toho kompatibilita izolované DNA s LAMP, což je metoda dobře vhodná pro analýzu nukleových kyselin v místě péče, dále demonstruje minimální požadavky na vybavení a vhodnost pro kolorimetrické testy (obr. 2b).
Metody magnetických kuliček nabízejí možnost automatizované extrakce, z nichž některé existují v komerčních automatizovaných extraktorech nukleových kyselin [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Peking, Čína) a Biomek®;Beckman (Miami, USA).), Florida, USA)].Výhody kombinace magnetických kuliček s mikrofluidikou lze využít pro účinnou automatizovanou extrakci nukleových kyselin, což by mohlo potenciálně posunout vývoj molekulární diagnostiky;avšak kombinace magnetických kuliček s mikrofluidikou stále silně spoléhá na komplexní řídicí systémy pro přesnou manipulaci s magnetickými kuličkami, což vysvětluje popularitu komerčních produktů, které jsou objemné a drahé, což omezuje další použití magnetických kuliček v POCT.
Pro detekci nukleových kyselin bylo také použito několik porézních materiálů, jako jsou modifikované nitrocelulózové filtry, karty Finders Technology Associates (FTA), filtrační papíry na bázi polyethersulfonu a materiály potažené glykanem [40, 41, 42, 43, 44].Porézní vláknité materiály, jako je vláknitý papír, byly poprvé použity k izolaci DNA fyzickým propletením dlouhovláknových molekul DNA s vlákny.Malé póry vedou k silnému fyzickému omezení molekul DNA, což pozitivně ovlivňuje extrakci DNA.Vzhledem k rozdílné velikosti pórů vláknitého papíru nemůže účinnost extrakce vyhovět potřebám amplifikace DNA [45, 46].Karta FTA je komerční filtrační papír používaný v oblasti soudního lékařství a široce používaný v jiných oblastech molekulární diagnostiky.Použitím celulózového filtračního papíru impregnovaného různými chemikáliemi k lýze buněčných membrán ve vzorku je uvolněná DNA chráněna před degradací po dobu až 2 let.V poslední době byl vyvinut impregnovaný celulózový papír pro molekulární detekci různých patogenů, včetně SARS-CoV-2, leishmaniózy a malárie [47,48,49].HIV v izolované plazmě je přímo lyžován a virová nukleová kyselina je obohacena v průtokové membráně FTA® zabudované v koncentrátoru, což umožňuje účinnou produkci nukleové kyseliny [50] (obr. 2c).Hlavním problémem detekce nukleových kyselin pomocí karet FTA je to, že chemikálie jako guanidin a isopropanol inhibují následné amplifikační reakce.Abychom tento problém vyřešili, vyvinuli jsme filtrační papír Fusion 5 modifikovaný chitosanem, který kombinuje výhody fyzického prokládání molekul DNA a vláknitého filtračního papíru a elektrostatické adsorpce DNA na sloučeniny modifikované chitosanem, aby bylo dosaženo vysoce účinné extrakce nukleových kyselin. ..filtračních vláken [51] (obr. 2d).Podobně Zhu et al.[52] prokázali chitosanem modifikovanou PCR metodu založenou na in situ kapilárním mikrofluidním systému pro rychlou izolaci a detekci RNA viru Zika.Nukleové kyseliny mohou být adsorbovány/desorbovány ve směsném médiu lyzát/PCR, v daném pořadí, na základě on/off switch vlastnosti chitosanu.zapnutí a vypnutí“, reagující na pH.
Jak bylo uvedeno výše, tyto strategie kombinují výhody různých materiálů na pevné fázi a zvyšují účinnost extrakce nukleových kyselin v mikrofluidikách.V praktických aplikacích je použití těchto materiálů ve velkém množství neekonomické a správnou povrchovou úpravou nebo povrchovou úpravou běžných materiálů těmito materiály lze zachovat jejich funkci.Proto se má za to, že implementace těchto strategií po pilotní studii může snížit náklady.
Testování nukleových kyselin na mikrofluidních platformách často používá malé objemy vzorků (< 100 µl), proto vyžaduje amplifikaci cílových nukleových kyselin pomocí specifických sond pro konverzi na signál, který je vhodný pro následnou detekci (optické, elektrické a magnetické) [53, 54]. Testování nukleových kyselin na mikrofluidních platformách často používá malé objemy vzorků (< 100 µl), proto vyžaduje amplifikaci cílových nukleových kyselin pomocí specifických sond pro konverzi na signál, který je vhodný pro následnou detekci (optické, elektrické a magnetické) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Při testování nukleových kyselin na mikrofluidních platformách se často používají malé objemy vzorků (<100 µl), takže je nutná amplifikace cílových nukleových kyselin pomocí speciálních sond, aby se převedly na signál vhodný pro následnou detekci (optické, elektrické a magnetické). [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 （（<100 µl） ， 因此 使用 特定 扩增 目标 ， 以 转换 为 便于 （（光学 电学 和 磁学） 的 信号 [53, 54 ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 特定 扩增 ， 以 转换 下游 下游 （光学 电学 磁学）） 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Detekce nukleových kyselin na mikrofluidních platformách obvykle využívá malé objemy vzorků (<100 μl), což vyžaduje amplifikaci cílových nukleových kyselin speciálními sondami k jejich převedení na signály pro následnou detekci (optické, elektrické a magnetické) [53, 54]] .Amplifikace nukleových kyselin v mikrofluidikách může také urychlit reakce, optimalizovat detekční limity, snížit požadavky na vzorky a zlepšit přesnost detekce [55, 56].V posledních letech, s realizací rychlé a přesné detekce, byly v mikrofluidice aplikovány různé metody amplifikace nukleových kyselin, včetně PCR a některých izotermických amplifikačních reakcí.Tato část shrnuje metody detekce nukleových kyselin založené na mikrofluidních systémech.
PCR je simulace procesu replikace DNA organismu, jejíž teorie je podrobně popsána jinde a nebude zde rozebírána.PCR může amplifikovat velmi malé množství cílové DNA/RNA exponenciální rychlostí, díky čemuž je PCR výkonným nástrojem pro rychlou detekci nukleových kyselin.V posledních desetiletích bylo vyvinuto mnoho přenosných mikrofluidních zařízení vybavených systémy tepelného cyklování PCR, aby vyhovovaly potřebám diagnostiky v místě péče [57, 58].On-chip PCR lze rozdělit do čtyř typů (konvenční, kontinuální, prostorově spínaná a konvektivní PCR) podle různých metod řízení teploty [59].Například Gee a kol.[60] vyvinuli metodu přímé reverzní transkripce kvantitativní PCR (RT-qPCR) na vlastní mikrofluidní platformě pro multiplexní detekci SARS-CoV-2, virů chřipky A a B ve vzorcích výtěrů z krku (obr. 3a).Park a kol.[61] vytvořil jednoduchý čip pro analýzu patogenů integrací tenkovrstvé PCR, elektrod a prstem ovládaného mikrofluidního modulu na bázi polydimethylsiloxanu.Obě práce však ztělesňují společné nedostatky konvenční PCR.PCR vyžaduje tepelné cyklování, což omezuje další miniaturizaci zařízení a zkracuje dobu testování.
Pro řešení tohoto problému je zásadní vývoj mikrofluidní a prostorově přepínané PCR založené na kontinuálním toku.Pomocí dlouhého hadovitého kanálu nebo krátkého přímého kanálu může kontinuální průtoková PCR poskytnout rychlou amplifikaci aktivní cirkulací činidel ve třech předehřívacích zónách s čerpadlem mimo čip.Tato operace úspěšně zamezuje přechodové fázi mezi různými reakčními teplotami a výrazně tak zkracuje dobu testování [62] (obr. 3b).V jiné studii Junga a kol.[63] navrhli nový rotační genetický analyzátor PCR, který kombinuje vlastnosti fixní a průtokové PCR pro ultrarychlou a multiplexní reverzní transkripční PCR (obr. 3c).Pro amplifikaci nukleové kyseliny bude PCR mikročip rotován přes tři zahřívací bloky při různých teplotách: 1. Denaturační blok 94°C, 2. Annealingový blok při 58°C, 3. Expanzní blok při 72°C.
Aplikace PCR v mikrofluidice.Schematické znázornění dirRT-qPCR na mikrofluidní platformě (upraveno z [60]).b Schematické znázornění kontinuálního průtokového PCR mikročipu založeného na hadovitém kanálu (upraveno z [62]).c Schematické znázornění rotačního PCR genetického analyzátoru, sestávajícího z mikročipu, tří topných bloků a krokového motoru (převzato z [63]).d Schéma termokonvekční PCR s centrifugací a nastavením (upraveno podle [64]).DirRT-qPCR, přímá kvantitativní reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce
Pomocí kapilár a smyček nebo dokonce tenkých destiček může konvekční PCR rychle amplifikovat nukleové kyseliny přirozenou volnou tepelnou konvekcí bez potřeby externí pumpy.Například mikrofluidní platforma cyklického olefinového polymeru byla vyvinuta na vyrobeném rotačním ohřívacím stupni, který využívá tepelné cyklování s centrifugací v mikrokanálu smyčky PCR [64] (obr. 3d).Reakční roztok je poháněn tepelnou konvekcí, která plynule vyměňuje vysokou a nízkou teplotu v mikrokanálu s prstencovou strukturou.Celý proces amplifikace lze dokončit za 10 minut s detekčním limitem 70,5 pg/kanál.
Jak se očekávalo, rychlá PCR je výkonný nástroj pro plně integrované systémy molekulární diagnostiky a multiplexní analýzy s odezvou vzorku.Rychlá PCR výrazně zkracuje čas potřebný k detekci SARS-CoV-2, což přispívá k účinné kontrole pandemie COVID-19.
PCR vyžaduje komplexní termocykler, který není vhodný pro POCT.V poslední době byly na mikrofluidiky aplikovány izotermické amplifikační techniky, včetně, ale bez omezení, LAMP, rekombinázové polymerázové amplifikace (RPA) a amplifikace založené na sekvencích nukleových kyselin [65,66,67,68].Pomocí těchto technik jsou nukleové kyseliny amplifikovány při konstantní teplotě, což usnadňuje vytvoření levných, vysoce citlivých přenosných POCT zařízení pro molekulární diagnostiku.
Vysoce výkonné testy LAMP na bázi mikrofluidiky umožňují vícenásobnou detekci infekčních onemocnění [42, 69, 70, 71].V kombinaci s odstředivým mikrofluidním systémem může LAMP dále usnadnit automatizaci detekce nukleových kyselin [69, 72, 73, 74, 75].Spinning and-react SlipChip byl vyvinut pro vizuální detekci více paralelních bakterií pomocí LAMP [76] (obr. 4a).Při použití optimalizované LAMP v testu byl poměr fluorescenčního signálu k šumu přibližně 5násobný a detekční limit dosáhl 7,2 kopií/μl genomové DNA. Existence pěti běžných trávicích bakteriálních patogenů, včetně Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis a Vibrio parahaemolyticus, byla navíc vizualizována na základě metody za < 60 min. Existence pěti běžných trávicích bakteriálních patogenů, včetně Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis a Vibrio parahaemolyticus, byla navíc vizualizována na základě metody za < 60 min.Kromě toho byla touto metodou vizualizována přítomnost pěti běžných bakteriálních patogenů trávicího traktu, včetně Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis a Vibrio parahaemolyticus, za méně než 60 minut.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 种 常见 消化道 原体 存在 ， 蜡状 芽孢杆菌 、 大 、 肠 沙门 氏 菌 河流 弧菌 和 副溶血性 弧菌。。。。 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 常见 消化道 细菌病 存在 包括 芽孢杆菌 、 肠杆菌 、 肠 氏 菌 弧菌 和 副溶血 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPKromě toho byla pomocí této metody vizualizována přítomnost pěti běžných bakteriálních gastrointestinálních patogenů, včetně Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius a Vibrio parahaemolyticus, a to za méně než 60 minut.
Mezi výhody LAMP v mikrofluidice patří mimo jiné rychlá odezva a miniaturizovaná detekce.Vzhledem k reakční teplotě (kolem 70 °C) však během LAMP nevyhnutelně vznikají aerosoly, což má za následek vysokou míru falešně pozitivních výsledků.Specifičnost testu, návrh primeru a kontrola teploty musí být také optimalizovány pro LAMP.Navíc návrhy čipů, které implementují detekci více cílů na jednom čipu, mají velkou hodnotu a měly by být vyvinuty.LAMP je navíc vhodný pro víceúčelovou detekci integrovanou v jednom čipu, což má velký význam, ale stále je zde velký prostor pro vývoj.
Vysoká míra falešně pozitivních LAMP může být částečně snížena pomocí RPA, protože relativně nízká reakční teplota (~37 °C) má za následek relativně málo problémů s vypařováním [77].V systému RPA dva protilehlé primery zahajují syntézu DNA vazbou na rekombinázu a amplifikace může být dokončena během 10 minut [78,79,80,81].Proto je celý proces RPA mnohem rychlejší než PCR nebo LAMP.V posledních letech se ukázalo, že mikrofluidní technologie dále zlepšuje rychlost a přesnost RPA [82,83,84].Například Liu a kol.[85] vyvinuli amplifikační test s laterálním průtokem polymerázy a rekombinázy s mikrofluidní integrací pro rychlou a citlivou detekci SARS-CoV-2 integrací reverzní transkripce RPA (RT-RPA) a univerzálního systému detekce testovacích proužků s laterálním tokem.do jediného mikrofluidního systému.Obrázek 4b).Limit detekce je 1 kopie/µl nebo 30 kopií/vzorek a detekce může být dokončena přibližně za 30 minut.Kong a kol.vyvinuli nositelné mikrofluidní zařízení.[86] použili tělesnou teplotu a fluorescenční detekční systém na mobilním telefonu k rychlé a přímé detekci DNA HIV-1 pomocí RPA (obrázek 4c).Nositelný test RPA detekuje 100 kopií/ml cílové sekvence během 24 minut, což prokazuje velký potenciál pro rychlou diagnostiku kojenců infikovaných HIV-1 v prostředí s omezenými zdroji.
Izotermická amplifikace při testování v místě péče (POCT).Vývoj a výroba spinových a reakčních čipů SlipChip.Po plazmovém svařování byly horní a spodní třísky sestaveny pomocí sady matic, aby vytvořily finální třísku (upraveno podle [76]).b Schéma systému MI-IF-RPA pro detekci COVID-19 (upraveno z [85]).c Schéma nositelného RPA testu pro rychlou detekci HIV-1 DNA (upraveno z [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboxyfluorescein, virus lidské imunodeficience HIV, amplifikace RPA rekombinázou polymerázou, LED dioda emitující světlo, MI-IF-RPA Microfluidics integrovaná Polymerní laterální rekombináza FAM Amplifikace
RPA na mikrofluidní bázi se rychle rozvíjí, nicméně náklady na výrobu čipu a spotřeba reakcí jsou příliš vysoké a je třeba je snížit, aby se zvýšila dostupnost této technologie.Kromě toho může vysoká citlivost RPA ovlivnit amplifikaci nespecifických produktů, zejména v přítomnosti kontaminace.Tato omezení mohou ovlivnit aplikaci RPA v mikrofluidních systémech a zasluhují další optimalizaci.Ke zlepšení proveditelnosti mikrofluidních strategií založených na RPA v POCT jsou také potřebné dobře navržené primery a sondy pro různé cíle.
Cas13 a Cas12a mají schopnost náhodně štěpit nukleové kyseliny, a proto mohou být vyvinuty jako detekční a diagnostické nástroje.Cas13 a Cas12a jsou aktivovány po navázání na cílovou DNA nebo RNA, v daném pořadí.Jakmile je protein aktivován, začne štěpit další blízké nukleové kyseliny, načež vodící RNA zacílené na patogen-specifické nukleové kyseliny mohou štěpit zhášené fluorescenční sondy a uvolnit fluorescenci.Na základě této teorie Kellner et al.[87] vyvinuli metodu založenou na Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)] a Broughton et al.[88] vyvinuli další přístup založený na Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
V posledních letech se objevily různé metody detekce nukleových kyselin na bázi CRISPR [89, 90].Konvenční metody založené na CRISPR jsou často časově náročné a pracné kvůli mnoha postupům včetně extrakce nukleové kyseliny, amplifikace a detekce CRISPR.Vystavení kapaliny vzduchu může zvýšit šanci na falešně pozitivní výsledky.Vzhledem k výše uvedenému systémy založené na CRISPR nutně potřebují optimalizaci.
Pro aplikace detekce CRISPR-Cas12a a CRISPR-Cas13a byla vyvinuta pneumaticky řízená mikrofluidní platforma, která může provádět 24 analýz paralelně [91].Systém je vybaven zařízením pro detekci fluorescence, které obchází amplifikaci nukleové kyseliny a automaticky detekuje femtomolární vzorky DNA a RNA.Chen a kol.[92] integrovali amplifikaci rekombinázy se systémem CRISPR-Cas12a v centrifugálních mikrofluidikách (obr. 5a).Tato práce překonává obtížnost integrace těchto dvou procesů, protože Cas12a může trávit messengerovou DNA a inhibovat proces amplifikace.Kromě toho Chen a kol.[92] navíc předem uložil reakční činidla v odstředivé mikrofluidní kontrole, aby se celý proces automaticky dokončil.V jiné práci Silva a spol.[93] vyvinuli diagnostickou metodu bez amplifikace CRISPR/Cas12a a chytrý telefon pro detekci SARS-CoV-2 (obr. 5b).Tento test, známý jako systém bez amplifikace na bázi mobilního telefonu, zahrnuje enzym závislý na CRISPR/Cas, který je založen na vizualizaci bublinových signálů generovaných katalázou v mikrofluidních kanálech smartphonem.Citlivá detekce méně než 50 kopií/µl nukleové kyseliny bez předamplifikace, celý proces od nástřiku vzorku po odečet signálu trvá pouze 71 minut.
Metody detekce nukleových kyselin založené na CRISPR.Centrifugální POCT pro integrovanou molekulární diagnostiku na bázi CRISPR (upraveno podle [92]).b Vývoj CASCADE testu pro analýzu SARS-CoV-2 pomocí chytrého telefonu (upraveno podle [93]).Rekombinázová amplifikace RAA, motiv protospaceru sousedící s PAM, CRISPR seskupené krátké palindromické repetice v pravidelných intervalech, systém CASCADE bez amplifikace mobilního telefonu s enzymy závislými na CRISPR/CAS, 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]karbodiimid hydrochlorid EDC
Jako poslední krok v detekci nukleových kyselin detekce signálu přímo odráží diagnostické výsledky a je kritickým faktorem při vývoji účinného, citlivého a přesného POCT.Signály lze číst pomocí různých metod, jako jsou fluorescenční, elektrochemické, kolorimetrické a magnetické strategie.V této části popisujeme zdůvodnění každého přístupu a porovnáváme molekulární diagnostiku infekčních onemocnění v mikrofluidice.
Strategie založené na fluorescenci jsou široce používány pro POCT diagnostiku infekčních onemocnění díky jejich pozoruhodným výhodám vynikající citlivosti, nízké ceně, snadnému provozu a analýze v místě péče [94, 95].Tyto strategie využívají značené fluorofory, jako jsou fluorescenční barviva a nanomateriály k vytvoření detekovatelného signálu (zesílení fluorescence nebo zhášení).Toto zjištění naznačuje, že strategie založené na fluorescenci lze rozdělit na přímé fluorescenční značení, fluorescenční detekci se zapnutým signálem a vypnutým signálem [96].Přímá detekce fluorescenční značky používá speciální fluorescenční značky ke značení specifických ligandů, které při selektivní vazbě na cíl generují specifické množství fluorescence.U fluorescenční detekce na bázi signálu kvalita fluorescenčního signálu pozitivně souvisí s velikostí zájmu.Intenzita fluorescence je zanedbatelná v nepřítomnosti cíle a je detekovatelná, když je přítomno dostatečné množství cíle.Naopak intenzita fluorescence detekovaná fluorescencí „vypnutého signálu“ je nepřímo úměrná množství cíle, zpočátku dosahuje maximální hodnoty a postupně klesá, jak se cíl zvětšuje.Například pomocí CRISPR-Cas13a cílově závislého trans-štěpícího mechanismu, Tian et al.[97] vyvinuli novou rozpoznávací strategii pro detekci RNA, které přímo obcházejí reverzní transkripci (obr. 6a).Po navázání na komplementární cílové RNA může být aktivován komplex CRISPR-Cas13-RNA, čímž se spustí transkolaterální štěpení nespecifickými reportérovými RNA.Fluorescenčně značený reportér [fluorofor (F)] je zhášen zhášečem (Q) intaktní a fluoreskuje, když je odštěpen aktivovaným komplexem.
Výhodou elektrochemické detekce je vysoká rychlost detekce, snadná výroba, nízká cena, snadné přenášení a automatické ovládání.Je to výkonná analytická metoda pro aplikace POCT.Na základě grafenových tranzistorů s efektem pole Gao et al.[98] vyvinuli nanobiosenzor pro multiplexní detekci antigenů lymské boreliózy z bakterií Borrelia burgdorferi s detekčním limitem 2 pg/ml (obr. 6b).
V aplikacích POCT byly použity kolorimetrické testy, které těžily z výhod přenositelnosti, nízké ceny, snadné přípravy a vizuálního čtení.Kolorimetrická detekce může využívat oxidaci peroxidázy nebo nanomateriálů podobných peroxidáze, agregaci nanomateriálů a přidání indikátorových barviv k převedení informace o přítomnosti cílových nukleových kyselin na viditelné barevné změny [99, 100, 101].Zlaté nanočástice jsou široce používány při vývoji kolorimetrických strategií a vzhledem k jejich schopnosti vyvolat rychlé a významné barevné změny vzrůstá zájem o vývoj kolorimetrických platforem POCT pro diagnostiku infekčních onemocnění in situ [102].S integrovaným odstředivým mikrofluidním zařízením [103] lze alimentární patogeny v kontaminovaných vzorcích mléka automaticky detekovat na úrovni 10 bakteriálních buněk a výsledky lze odečítat vizuálně do 65 minut (obr. 6c).
Techniky magnetického snímání mohou přesně detekovat analyty pomocí magnetických materiálů a v posledních desetiletích je značný zájem o aplikace POCT.Techniky magnetického snímání mají některé jedinečné výhody, jako jsou levné magnetické materiály spíše než drahé optické komponenty.Použití magnetického pole však zlepšuje účinnost detekce a zkracuje dobu přípravy vzorku [104].Kromě toho výsledky magnetického sondování prokazují vysokou specificitu, citlivost a vysoký poměr signálu k šumu v důsledku nevýznamného signálu magnetického pozadí biologických vzorků [105].Sharma a kol.integroval biosenzor na bázi magnetického tunelového spojení do přenosné mikročipové platformy.[106] pro multiplexní detekci patogenů (obr. 6d).Biosenzory citlivě detekují subnanomolární nukleové kyseliny izolované z patogenů.
Typická metoda detekce signálu.Koncept hyperlokalizované detekce Cas13a (upraveno z [97]).b Grafenový nanobiosenzorový FET v kombinaci s Lyme GroES scFv (upraveno podle [98]).c Kolorimetrické indikace pro multiplexní detekci alimentárních patogenů v odstředivém mikrofluidním čipu: vzorky č. 1 a č. 3 s cílovými patogeny a vzorky č. 2, č. 4 a č. 5 bez cílových patogenů (upraveno podle [103]) .d Biosenzor na bázi magnetického tunelového spojení, včetně platformy, vestavěného blokovacího zesilovače, řídicí jednotky a napájecího zdroje pro generování/získávání signálu (převzato z [106]).GFET Grafen FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polymethylmethakrylát
Navzdory vynikajícím vlastnostem výše uvedených metod detekce mají stále své nevýhody.Tyto metody jsou porovnány (tabulka 1), včetně některých aplikací s podrobnostmi (pro a proti).
S rozvojem mikrofluidiky, mikroelektromechanických systémů, nanotechnologií a materiálové vědy se využití mikrofluidních čipů pro detekci infekčních onemocnění neustále posouvá kupředu [55,96,107,108].Přesná manipulace s miniaturními zařízeními a kapalinami přispívá k diagnostické přesnosti a hospodárnosti.Proto bylo pro další vývoj vynaloženo úsilí na optimalizaci a upgrade čipů, což má za následek různé mikrofluidní čipy s různými strukturami a funkcemi.Zde stručně představíme několik běžných typů mikrofluidních platforem a porovnáme jejich vlastnosti (pro a proti).Většina níže uvedených příkladů se navíc zaměřuje především na boj proti SARS-CoV-2.
LOCC jsou nejběžnější miniaturizované komplexní analytické systémy a jejich operace jsou vysoce miniaturizované, integrované, automatizované a paralelizované od vstřikování a přípravy vzorku, řízení průtoku a detekce kapalin [109, 110].S kapalinami se manipuluje prostřednictvím pečlivě navržené geometrie a interakce mnoha fyzikálních jevů, jako jsou tlakové gradienty, kapilární působení, elektrodynamika, magnetická pole a akustické vlny [111].LOCC vykazuje vynikající výhody ve vysoce výkonném screeningu a vícenásobné detekci s vysokou rychlostí analýzy, malou velikostí vzorku, nízkou spotřebou energie a vysokou účinností správy a provozu;zařízení LOCC jsou však velmi choulostivá a jejich výroba, balení a propojení.Avšak multiplexování a opětovné použití čelí obrovským potížím [96].Ve srovnání s jinými platformami má LOCC jedinečné výhody z hlediska maximální rozmanitosti aplikací a nejlepší technologické kompatibility, ale zřejmé jsou i jeho nevýhody, a to vysoká složitost a špatná opakovatelnost.Závislost na externích čerpadlech, která jsou často objemná a drahá, dále omezuje jejich použití v POCT.
Během vypuknutí COVID-19 se LOCC dostalo velké pozornosti.Zároveň existuje několik nových čipů, které kombinují několik technologií.Například chytré telefony jsou nyní široce používány jako přenosná analytická zařízení a mají velký potenciál pro integraci LOCC.Sun a kol.[21] vyrobili mikrofluidní čip, který umožňuje multiplexovat specifické sekvence nukleových kyselin pěti patogenů, včetně SARS-CoV-2, pomocí LAMP a analyzovali je pomocí smartphonu do 1 hodiny po skončení reakce.Jako další příklad Sundah et al.[112] vytvořili molekulární přepínač [katalytická amplifikace pomocí přepínače molekulárního přechodového stavu (CATCH)] pro přímou a citlivou detekci RNA cílů SARS-CoV-2 pomocí chytrých telefonů. CATCH je kompatibilní s přenosným LOCC a dosahuje vynikajícího výkonu (přibližně 8 kopií RNA/μl; < 1 h při pokojové teplotě) [112]. CATCH je kompatibilní s přenosným LOCC a dosahuje vynikajícího výkonu (přibližně 8 kopií RNA/μl; < 1 h při pokojové teplotě) [112]. Catch совместим с портативным Locc и обеспечивает превосходную производител к р р р р р р р р. CATCH je kompatibilní s přenosným LOCC a poskytuje vynikající propustnost (přibližně 8 kopií RNA/µl; < 1 h při pokojové teplotě) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时]） CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时]） Catch совместим с портативными Locc и обладает превосходной произ ре) CATCH je kompatibilní s přenosnými LOCC a má vynikající výkon (přibližně 8 kopií RNA/µl; < 1 hodina při pokojové teplotě) [112].Kromě toho zařízení LOCC pro molekulární diagnostiku také využívají některé hnací síly, jako je vakuum, roztažení a elektrická pole.Kang a kol.[113] prokázali ultrarychlou nanoplasma-on-a-chip PCR v reálném čase pro rychlou a kvantitativní diagnostiku COVID-19 v terénu pomocí vakuového plasmonického kapalného PCR čipu.Li a kol.[114] následně vyvinuli mikrofluidní čip řízený natahováním, který umožnil diagnostiku COVID-19.Platforma používá amplifikační systém RT-LAMP k určení, zda je vzorek kvalitativně pozitivní nebo negativní.Následně Ramachandran a kol.[115] dosáhli vhodných gradientů elektrického pole pomocí izotachoforézy (ITP), selektivní iontové fokusační techniky implementované v mikrofluidice.Pomocí ITP lze automaticky purifikovat cílovou RNA ze vzorků surového nazofaryngeálního výtěru.Poté Ramachandran a spol.[115] Kombinací této purifikace ITP s testy LAMP a CRISPR zesílenými ITP detekoval SARS-CoV-2 ve výtěru z nosohltanu člověka a klinických vzorcích za přibližně 35 minut.Navíc se neustále objevují nové nápady.Jadhav a kol.[116] navrhli diagnostické schéma založené na Ramanově spektroskopii s vylepšeným povrchem v kombinaci s mikrofluidním zařízením obsahujícím buď vertikálně orientované uhlíkové nanotrubičky potažené zlatem/stříbrem nebo jednorázové elektrospřádané mikro/nanotrubičky.Membránou funkcionalizované vestavěné filtrační mikrokanály jsou jednorázové.Zařízení adsorbuje viry z různých tělesných tekutin/exsudací, jako jsou sliny, nosohltan a slzy.Titr viru je tedy bohatý a virus lze přesně identifikovat podle Ramanovy signatury.
LOAD je odstředivá mikrofluidní platforma, ve které jsou všechny procesy řízeny frekvenčním protokolem, který otáčí mikrostrukturovaným substrátem [110].Zařízení LOAD se vyznačuje tím, že jako důležitou hnací sílu využívá odstředivou sílu.Kapaliny také podléhají kapilárním, Eulerovým a Coriolisovým silám.Pomocí odstředivky se analýzy provádějí v nepřetržitém kapalinovém provozu od radiální polohy směrem dovnitř k vnější, čímž se eliminuje potřeba dalších externích hadic, čerpadel, pohonů a aktivních ventilů.Stručně řečeno, jediný způsob ovládání zjednodušuje ovládání.Síly působící na kapalinu ve stejném mikrofluidním kanálu ve stejné vzdálenosti od středu zatížení jsou stejné, což umožňuje opakování struktury kanálu.Zařízení LOAD je tedy jednodušší a ekonomičtější z hlediska návrhu a výroby než konvenční zařízení LOCC, zatímco reakce jsou do značné míry nezávislé a paralelní;vzhledem k vysoké mechanické pevnosti odstředivého zařízení je však dostupný materiál třísek omezený a malé objemy jsou obtížné.do auta.Zároveň je většina LOAD zařízení navržena pouze pro jednorázové použití, což je drahé pro detekci ve velkém měřítku [96, 117, 118, 119].
V posledních desetiletích se LOAD, považovanému za jedno z nejslibnějších mikrofluidních zařízení, dostalo značné pozornosti výzkumníků a výrobců.LOAD tak získal široké přijetí a byl použit pro molekulární diagnostiku infekčních patogenů [120, 121, 122, 123, 124], zejména během vypuknutí COVID-19.Například na konci roku 2020 Ji a spol.[60] prokázali přímý test RT-qPCR pro rychlou a automatizovanou paralelní detekci SARS-CoV-2 a infekcí chřipkou A a B ve vzorcích výtěrů z krku.Pak Xiong a spol.[74] představili diskoidní mikrofluidní platformu integrovanou LAMP pro rychlou, přesnou a současnou detekci sedmi lidských respiračních koronavirů, včetně SARS-CoV-2, během 40 minut.Na začátku roku 2021 de Oliveira et al.[73] demonstrovali polystyrenový tonerový odstředivý mikrofluidní čip, ručně ovládaný pomocí rotátoru konečků prstů, pro molekulární diagnostiku COVID-19 pomocí RT-LAMP.Následně Dignan a kol.[39] představili automatizované přenosné centrifugační mikrozařízení pro purifikaci RNA SARS-CoV-2 přímo z řezů bukálních výtěrů.Medved a kol.[53] navrhli inline systém odběru vzorků aerosolu SARS-CoV-2 s maloobjemovým rotujícím mikrofluidním fluorescenčním čipem s detekčním limitem 10 kopií/μl a minimálním prahem cyklu 15 minut.Suarez a kol.[75] nedávno informovali o vývoji integrované modulární odstředivé mikrofluidní platformy pro přímou detekci RNA SARS-CoV-2 v tepelně inaktivovaných vzorcích nasofaryngeálních výtěrů pomocí LAMP.Tyto příklady demonstrují velké výhody a příslib LOAD v molekulární diagnostice COVID-19.
V roce 1945 Muller a Clegg [125] poprvé představili mikrofluidní kanály na papíře s použitím filtračního papíru a parafínu.V roce 2007 vytvořila skupina Whitesides [126] první funkční papírovou platformu pro testování bílkovin a glukózy.Papír se stal ideálním substrátem pro mikrofluidiku.Papír má vlastní vlastnosti, jako je hydrofilita a porézní struktura, vynikající biokompatibilita, nízká hmotnost, flexibilita, skládací, nízká cena, snadné použití a pohodlí.Klasické µPAD se skládají z hydrofilních/hydrofobních struktur postavených na papírových substrátech.V závislosti na trojrozměrné struktuře lze μPAD rozdělit na dvourozměrné (2D) a trojrozměrné (3D) μPAD.2D µPAD se vyrábí vytvořením hydrofobních hranic za účelem vytvoření mikrofluidních kanálů, zatímco 3D µPAD jsou obvykle vyrobeny ze stohů vrstev 2D mikrofluidního papíru, někdy skládáním papíru, skluzovými technikami, otevřenými kanály a 3D tiskem [96].Vodné nebo biologické tekutiny na μPAD jsou primárně řízeny kapilární silou bez externího zdroje energie, což usnadňuje předskladování reagencií, manipulaci se vzorky a multiplexní detekci.Přesné řízení průtoku a multiplexní detekce však brání nedostatečná rychlost detekce, citlivost a opětovná použitelnost [96, 127, 128, 129, 130].
Jako neobvyklá mikrofluidní platforma byl μPAD široce propagován a vyvinut pro molekulární diagnostiku infekčních onemocnění, jako je HCV, HIV a SARS-CoV-2 [131, 132].Pro selektivní a citlivou detekci HCV Tengam et al.[133] vyvinuli nový biosenzor založený na fluorescenčním papíru s použitím vysoce specifické sondy nukleové kyseliny na bázi pyrrolidinylpeptidu.Nukleové kyseliny jsou kovalentně imobilizovány na částečně oxidovaném celulózovém papíru redukční alkylací mezi aminoskupinami a aldehydovými skupinami a detekce je založena na fluorescenci.Tyto signály lze číst speciálně vyrobeným gadgetem s přenosnou fluorescenční kamerou v kombinaci s kamerou mobilního telefonu.Následně Lu a kol.[134] navrhli flexibilní elektrodu na papírové bázi na bázi nanočástic niklu/zlata/uhlíkových nanotrubiček/polyvinylalkoholových organokovových strukturních kompozitů pro detekci cíle HIV pomocí hybridizace DNA s použitím methylenové modři jako redoxního indikátoru DNA.Nedávno Chowdury et al.[135] představili návrh hypotetické platformy pro testování µPAD v místě péče pomocí nezpracovaných slin pacienta v kombinaci s LAMP a přenosnou zobrazovací technologií pro detekci analytu COVID-19.
Testy laterálního proudění vedou tekutiny kapilárními silami a řídí pohyb tekutiny smáčivostí a charakteristikami porézních nebo mikrostrukturovaných substrátů.Zařízení pro laterální průtok se skládají ze vzorku, konjugátu, inkubátoru a detekce a absorpčních polštářků.Molekuly nukleové kyseliny v LFA rozpoznávají specifické vazebné látky, které jsou předem uloženy na vazebném místě a vážou se jako komplexy.Když kapalina prochází inkubačními a detekčními plotnami, jsou komplexy zachyceny záchytnými molekulami umístěnými na testovací a kontrolní linii, což ukazuje výsledky, které lze odečíst přímo pouhým okem.Typicky lze LFA dokončit za 2–15 minut, což je rychlejší než tradiční objevování.Díky speciálnímu mechanismu vyžaduje LFA málo operací a nevyžaduje další vybavení, díky čemuž je velmi uživatelsky přívětivý.Snadno se vyrábí a miniaturizuje a náklady na papírové substráty jsou nižší.Používá se však pouze pro kvalitativní analýzu a kvantitativní detekce je velmi obtížná a schopnost multiplexování a propustnost jsou velmi omezené a v daném okamžiku lze detekovat pouze jednu dostatečnou nukleovou kyselinu [96,110,127].
Ačkoli je většina aplikací LFA zaměřena na imunotesty, efektivní a oblíbené je také použití LFA pro molekulární diagnostiku v mikrofluidních čipech [136].V případě viru hepatitidy B, HIV a SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] navrhli platformu LFA nanočástic s vyšší konverzí a prokázali všestrannost této miniaturizované a přenosné platformy prostřednictvím citlivé a kvantitativní detekce více cílů, jako je nukleová kyselina HBV.Kromě toho Fu a kol.[138] prokázali novou LFA založenou na Ramanově spektroskopii se zesíleným povrchem pro kvantitativní analýzu DNA HIV-1 při nízkých koncentracích.Pro rychlou a citlivou detekci SARS-CoV-2 Liu et al.[85] vyvinuli mikrofluidní integrovanou analýzu laterálního toku RPA kombinací RT-RPA a univerzálního systému detekce laterálního toku do jediného mikrofluidního systému.
Aplikace různých mikrofluidních platforem se liší v závislosti na konkrétních studiích, přičemž se plně využívají možnosti a výhody platforem.Díky cenově dostupným ventilům, čerpadlům a potrubí je LOCC nejkomplexnější platformou pro rozmanitost aplikací a interoperabilitu s největším prostorem pro vývoj.Proto doufáme a doporučujeme, aby byly na LOCC jako první pokus provedeny nejnovější studie a podmínky byly optimalizovány.Kromě toho se očekává, že budou v systému objeveny a použity účinnější a přesnější metody.LOAD vyniká přesným řízením tekutin ze stávajících zařízení LOCC a demonstruje jedinečné výhody v jednotlivých pohonech pomocí odstředivé síly bez potřeby externích pohonů, přičemž paralelní odezvy lze oddělit a synchronizovat.V budoucnu se tak LOAD stane hlavní mikrofluidní platformou s méně manuálními operacemi a vyspělejšími a automatizovanými technologiemi.Platforma µPAD kombinuje výhody LOCC a materiálů na bázi papíru pro nízkonákladovou diagnostiku na jedno použití.Budoucí vývoj by se proto měl zaměřit na pohodlné a dobře zavedené technologie.Kromě toho se LFA dobře hodí pro detekci pouhým okem, což slibuje snížení spotřeby vzorku a urychlení detekce.Podrobné srovnání platforem je uvedeno v tabulce 2.
Digitální analýzy rozdělují vzorek do mnoha mikroreaktorů, z nichž každý obsahuje diskrétní počet cílových molekul [139, 140].Digitální testy nabízejí významné výhody pro provádění absolutní kvantifikace tím, že provádějí tisíce paralelních biochemických experimentů současně a jednotlivě v kompartmentech v mikronovém měřítku spíše než v kontinuální fázi.Ve srovnání s tradiční mikrofluidikou mohou kompartmentové reakce snížit objem vzorku, zvýšit účinnost reakce a lze je snadno integrovat s jinými analytickými metodami bez potřeby kanálů, čerpadel, ventilů a kompaktních konstrukcí [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Následující dvě metody se používají v digitálních testech k dosažení jednotné a přesné separace roztoků, včetně činidel a vzorků, jako jsou buňky, nukleové kyseliny a další částice nebo molekuly: (1) kapkové emulze využívající nestability kapalného rozhraní;(2) dělení pole se provádí geometrickými omezeními zařízení.V první metodě mohou být kapičky obsahující činidla a vzorky v mikrokanálech vytvořeny pasivními metodami, jako je souproud, křížový tok, fokusace toku, stupňovitá emulgace, mikrokanálová emulgace a membrány prostřednictvím viskózních smykových sil a emulgace se změnou kanálu.lokalizace [143, 145, 146, 148, 149] nebo pomocí aktivních metod [150, 151], které přivádějí další energii prostřednictvím elektrického, magnetického, tepelného a mechanického řízení.V posledně uvedeném přístupu je nejlepší jednotnost objemu tekutiny v mikrofluidních komorách sdílena udržováním prostorových struktur stejné velikosti, jako jsou mikrojamky a povrchová pole [152,153,154].Pozoruhodné je, že kapičky jsou hlavní průtokové sekce, které lze také generovat a manipulovat s nimi na elektrodových polích založených na digitální mikrofluidice (DMF).Elektrosmáčení dielektrik je jednou z nejlépe prostudovaných teorií DMF, protože elektrosmáčení dielektrik umožňuje přesnou manipulaci s jednotlivými kapkami, řízení tvaru kapaliny a asymetrické elektrické signály procházející různými stranami [141, 144].Mezi hlavní operace s kapkami v DMF patří třídění, štěpení a slučování [151, 155, 156], které lze použít v různých oblastech analýzy, zejména v molekulární detekci [157, 158, 159].
Digitální detekce nukleových kyselin je molekulární diagnostická technologie třetí generace navazující na konvenční PCR a kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR), paralelně s vysoce výkonným sekvenováním a tekutou biopsií.V posledních dvou desetiletích se digitální nukleové kyseliny rychle rozvinuly v oblasti molekulární diagnostiky infekčních patogenů [160, 161, 162].Absolutní kvantifikace digitální detekce nukleové kyseliny začíná balením vzorků a činidel do jednotlivých kompartmentů, aby bylo zajištěno, že každá cílová sekvence má stejnou pravděpodobnost vstupu do každého jednotlivého kompartmentu.Teoreticky může být každé sekci přiřazeno více cílových sekvencí, nebo zde nemusí existovat nezávislý mikroreakční systém.Prostřednictvím různých snímacích mechanismů popsaných výše mohou být kompartmenty s mikrobiálními cílovými sekvencemi, které generují signály nad určitou prahovou hodnotou, vizualizovány pouhým okem nebo strojem a jsou označeny jako pozitivní, zatímco jiné kompartmenty, které generují signály pod prahovou hodnotou, jsou označeny jako pozitivní. .záporné, díky nimž je signál pro každou sekci booleovský.Výpočtem počtu vytvořených kompartmentů a míry pozitivních výsledků po reakci lze tedy porovnat původní kopie testovacích vzorků pomocí Poissonova distribučního vzorce bez potřeby standardní křivky, která je vyžadována pro rutinní kvantitativní analýzy, jako je např. jako qPCR.[163] Ve srovnání s tradičními molekulárními diagnostickými metodami má digitální detekce nukleových kyselin vyšší stupeň automatizace, vyšší rychlost a citlivost analýzy, méně činidel, menší kontaminaci a jednodušší design a výrobu.Z těchto důvodů bylo během kritického vypuknutí SARS-CoV-2 dobře studováno použití digitálních testů, zejména metod založených na kapkách, pro molekulární diagnostiku, kombinující techniky amplifikace a čtení signálu.Například Yin a kol.[164] kombinovali kapkové digitální a rychlé metody PCR k detekci genů ORF1ab, N a RNázy P v SARS-CoV-2 v mikrofluidním čipu.Je pozoruhodné, že systém byl schopen identifikovat pozitivní signál během 115 sekund, což je rychlejší než konvenční PCR, což ukazuje na jeho účinnost při detekci v místě péče (obrázek 7a).Dong a kol.[165], Sow a kol.[157], Chen a kol.[166] a Alteri et al.[167] také použili kapkovou digitální PCR (ddPCR) k detekci SARS-CoV-2 v mikrofluidním systému s působivými výsledky.Pro další zlepšení míry detekce Shen et al.[168] dosáhli čipového zobrazování založeného na ddPCR za pouhých 15 s bez použití technik spojování obrazu, což urychlilo proces technologie ddPCR z laboratoře do aplikace.Používají se nejen metody tepelné amplifikace, jako je PCR, ale také metody izotermické amplifikace pro zjednodušení reakčních podmínek a rychlé odezvy.Lu a kol.[71] vyvinuli SlipChip pro analýzu kapiček, schopný generovat kapičky různých velikostí při vysokých hustotách v jednom kroku a kvantifikovat nukleové kyseliny SARS-CoV-2 pomocí digitální LAMP (obrázek 7b).Jako rychle se vyvíjející technologie může CRISPR také hrát důležitou roli v digitální detekci nukleových kyselin prostřednictvím pohodlného kolorimetrického zobrazování bez potřeby dalších barvení nukleových kyselin.Ackerman a kol.vyvinuli kombinatorickou matricovou reakci pro multiplexní hodnocení nukleových kyselin.[158] detekovali 169 virů spojených s člověkem, včetně SARS-CoV-2, v kapičkách obsahujících reagencie pro detekci nukleových kyselin na bázi CRISPR-Cas13 v mikrojamkovém testu (obrázek 7c).Kromě toho lze ve stejném systému použít izotermické zesílení a technologii CRISPR, aby se spojily výhody obou.Park a kol.[169] Digitální test CRISPR/Cas12a byl vyvinut v komerčním mikrofluidním čipu pro detekci extrahovaného a teplem usmrceného SARS-CoV-2 na základě jednostupňové RT-RPA s kratší a vyšší detekcí signálu na pozadí. časový poměr., širší dynamický rozsah a lepší citlivost (obr. 7d).Některé popisy těchto příkladů jsou uvedeny v tabulce 3.
Typická digitální platforma pro detekci nukleových kyselin.a Rychlý digitální pracovní postup PCR se skládá ze čtyř klíčových kroků: příprava vzorku, distribuce reakční směsi, proces amplifikace a kvantifikace cíle (upraveno podle [164]).b Schéma znázorňující analýzu kapiček SlipChip pro tvorbu kapiček při vysoké hustotě (upraveno podle [71]).c Diagram pracovního postupu CARMEN-Cas13 (převzato z [158]).d Přehled pokročilé digitální detekce virů pomocí CRISPR/Cas v jednom hrnci (převzato z [169]).W/O voda v oleji, polydimethylsiloxan PDMS, PCR polymerázová řetězová reakce, sběr dat DAQ, PID proporcionální integrální derivace, CARMEN kombinatorická matricová reakce pro vyhodnocení multiplexních nukleových kyselin, SARS-CoV-2, těžký akutní respirační syndrom, koronavirus 2 , RT Amplifikace reverzní transkriptázy rekombináza polymeráza-RPA, S/B signál v pozadí
Čas odeslání: 15. září 2022
