Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Metody enzymatického proximitního značení založené na aktivovaných esterech nebo fenoxy radikálech jsou široce používány k mapování subcelulárních proteomů a proteinových interaktorů v živých buňkách.Aktivované estery jsou však méně reaktivní, což má za následek široký rádius značení a fenoxy radikály generované působením peroxidu mohou interferovat s redoxními cestami.Zde uvádíme metodu fotoaktivace závislé na přiblížení (PDPL) vyvinutou genetickým spojením proteinu fotosenzibilizátoru miniSOG k proteinu zájmu.Spouštěný modrým světlem a řízený dobou expozice je generován singletový kyslík a poté je dosaženo časoprostorově vyřešeného značení histidinových zbytků anilinovou sondou.Jeho vysokou věrnost demonstrujeme prostřednictvím mapování proteomu specifického pro organely.Porovnání PDPL vedle sebe s TurboID ukazuje konkrétnější a komplexnější proteomické pokrytí PDPL.Dále jsme aplikovali PDPL na transkripční koaktivátor BRD4 a E3 Parkin ligázu spojený s onemocněním a našli jsme dříve neznámé interaktory.Skríningem nadměrné exprese byly identifikovány dva neznámé substráty, Ssu72 a SNW1, pro Parkin, jehož degradace je zprostředkována ubikvitinační-proteazomovou cestou.
Přesná charakterizace proteinových sítí je základem mnoha základních buněčných procesů.Proto vysoce přesné časoprostorové mapování proteinových interakcí poskytne molekulární základ pro dešifrování biologických drah, patologie onemocnění a narušení těchto interakcí pro terapeutické účely.Za tímto účelem jsou vysoce žádoucí metody schopné detekovat časové interakce v živých buňkách nebo tkáních.Afinitní purifikační hmotnostní spektrometrie (AP-MS) se historicky používala k identifikaci vazebných partnerů zájmových proteinů (POI).S rozvojem kvantitativních proteomických metod vznikla Bioplex3.0, největší databáze proteinových sítí na bázi AP-MS.Ačkoli AP-MS je velmi silný, kroky buněčné lýzy a ředění v pracovním postupu jsou zaměřeny na slabé a přechodné vazebné interakce a zavádějí artefakty po lýze, jako jsou falešné interakční páry, kterým před lýzou chybí kompartmentalizace.
K řešení těchto problémů byly vyvinuty nepřirozené aminokyseliny (UAA) se síťovacími skupinami a platformy pro enzymatické blízké značení (PL) (např. APEX a BioID)5.Přestože metoda UAA byla úspěšně aplikována v mnoha scénářích a poskytuje informace o přímých proteinových adhezivech, je stále nutná optimalizace místa inzerce UAA.Důležitější je, že jde o stechiometrický způsob značení, který postrádá katalytické obrácení událostí značení.Na rozdíl od toho enzymatické metody PL, jako je metoda BioID, fúzují upravenou biotin ligázu s POI7, která následně aktivuje biotin za vzniku reaktivního biotinyl-AMP esterového meziproduktu.Enzym tak katalyzuje a uvolňuje aktivovaný biotinový „oblak“, který označuje proximální lysinové zbytky.BioID však vyžaduje více než 12 hodin k získání dostatečně označeného signálu, což vylučuje jeho použití s časovým rozlišením.Použitím řízené evoluce založené na kvasinkovém displeji byl TurboID navržen na základě BioID tak, aby byl účinnější a umožňoval účinné značení biotinem během 10 minut, což umožňuje studovat dynamičtější procesy.Protože TurboID je vysoce aktivní a hladiny endogenního biotinu jsou dostatečné pro nízkoúrovňové značení, stává se značení na pozadí potenciálním problémem, když je vyžadováno vysoce zesílené a načasované značení přidáním exogenního biotinu.Kromě toho jsou aktivované estery málo reaktivní (t1/2 ~5 min), což může vést k velkému rádiusu značení, zejména po nasycení sousedních proteinů biotinem 5. V jiném přístupu je genetická fúze upravené askorbátperoxidázy (tj. biotin- fenolové radikály a umožňuje značení proteinů během jedné minuty9,10 APEX se široce používá k identifikaci subcelulárních proteomů, komplexů membránových proteinů a cytosolických signálních proteinových komplexů.11,12 Potřeba vysokých koncentrací peroxidů však může ovlivnit redox proteiny nebo dráhy, narušit buněčné procesy.
Důležitým doplňkem stávajících metod tedy bude nová metoda schopná generovat reaktivnější druhy potlačující značený poloměr s vysokou prostorovou a časovou přesností bez významného narušení buněčných drah. Mezi reaktivními druhy vzbudil naši pozornost singletový kyslík pro svou krátkou životnost a omezený poloměr difúze (t1/2 < 0,6 µs v buňkách)13. Mezi reaktivními druhy vzbudil naši pozornost singletový kyslík pro svou krátkou životnost a omezený poloměr difúze (t1/2 < 0,6 µs v buňkách)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Z aktivních forem upoutal naši pozornost singletový kyslík pro svou krátkou životnost a omezený poloměr difúze (t1/2 < 0,6 µs v buňkách)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs／躻巕䨕伄艏軑 䨕伄 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Z aktivních forem přitahuje naši pozornost singletový kyslík pro svou krátkou životnost a omezený poloměr difúze (t1/2 < 0,6 μs v buňkách).Bylo popsáno, že singletový kyslík náhodně oxiduje methionin, tyrosin, histidin a tryptofan, takže je polární 14,15 pro připojení k sondám na bázi aminu nebo thiolu16,17.Ačkoli singletový kyslík byl použit ke značení subcelulární kompartmentové RNA, strategie pro opětovné použití endogenních markerů blízkosti POI zůstávají neprozkoumané.Zde představujeme platformu nazvanou fotoaktivace závislé značení přiblížení (PDPL), kde používáme modré světlo k osvětlení POI spojených s fotosenzibilizátorem miniSOG a spouštíme generování singletového kyslíku k oxidaci proximálních zbytků, následované modifikacemi obsahujícími aminy k oxidaci chemických sond do střední živé buňky..Testovali jsme skupinu chemických sond, abychom maximalizovali specificitu značky a identifikovali místa modifikace pomocí otevřeného pracovního postupu proteomiky.Porovnání PDPL vedle sebe s TurboID ukazuje konkrétnější a komplexnější proteomické pokrytí PDPL.Tento přístup jsme aplikovali na organelově specifické markery subcelulárního proteomu a obecnou proteomovou identifikaci vazebných partnerů pro s rakovinou asociovaný epigenetický regulační protein BRD4 a E3 ligázu Parkin asociovanou s Parkinsonovou chorobou, což potvrdilo jak známou, tak neznámou síť proteinů interakce..Schopnost PDPL rozpoznávat E3 substráty ve velkých proteinových komplexech představuje situaci, kdy je vyžadováno rozpoznání nepřímých vazebných látek.In situ byly potvrzeny dva neznámé parkinové substráty zprostředkované ubikvitinačním proteazomem.
Fotodynamická terapie (PDT)19 a chromoforem asistovaná laserová inaktivace (CALI)20, při kterých světelné ozáření fotosenzibilizátory generuje singletový kyslík, může inaktivovat cílové proteiny nebo způsobit buněčnou smrt.Jelikož singletový kyslík je vysoce reaktivní látka s teoretickou difúzní vzdáleností asi 70 nm, lze regulovat prostorově omezenou oxidaci kolem fotosenzibilizátoru.Na základě tohoto konceptu jsme se rozhodli použít singletový kyslík k dosažení těsného značení proteinových komplexů v živých buňkách.Vyvinuli jsme PDPL chemoproteomický přístup, který splňuje čtyři funkce: (1) katalyzovat tvorbu aktivního singletového kyslíku podobný PL enzymatickému přístupu;(2) poskytnout časově rozlišené značení po iniciaci světla;(3) změnou (4) Vyhněte se používání endogenních kofaktorů (jako je biotin) ke snížení pozadí nebo používejte vysoce rušivá exogenní činidla (jako jsou peroxidy), abyste minimalizovali vystavení buněk environmentálnímu stresu.
Fotosenzibilizátory lze rozdělit do dvou kategorií včetně fluoroforů s malou molekulovou hmotností (např. bengálská růže, methylenová modř)22 a geneticky kódovaných malých proteinů (např. miniSOG, KillerRed)23.Abychom dosáhli modulárního designu, vyvinuli jsme první generaci platformy PDPL přidáním proteinů fotosenzibilizátoru (PS) k POI24,25 (obrázek 1a).Když je singletový kyslík ozářen modrým světlem, oxiduje proximální nukleofilní aminokyselinové zbytky, což vede k umpolungové polaritě, která je elektrofilní a může dále reagovat s nukleofily aminové sondy16,17.Sonda je navržena s alkynovou rukojetí, která umožňuje chemii kliknutí a tažení dolů pro charakterizaci LC/MS/MS.
Schematické znázornění značení proteinových komplexů zprostředkované miniSOG.Když jsou vystaveny modrému světlu, buňky exprimující miniSOG-POI generují singletový kyslík, který modifikuje interagující proteiny, ale ne nevazebné proteiny.Meziprodukty fotooxidace jsou zachyceny přenosovými značkami aminové chemické sondy za vzniku kovalentních aduktů.Alkynylová skupina na chemické sondě umožňuje click chemii pro obohacení pull-down následovaným LC-MS/MS kvantifikací.b Chemická struktura aminových sond 1-4.c Reprezentativní fluorescenční gelová analýza mitochondriálně lokalizovaných proteomických markerů zprostředkovaných miniSOG pomocí sond 1-4 a relativní kvantifikace založené na gelové denzitometrii.Poměr signálu k pozadí chemických sond byl hodnocen pomocí negativních kontrolních experimentů s vyloučením modrého světla nebo s použitím buněk HEK293T bez exprese miniSOG.n = 2 biologicky nezávislé vzorky.Každá tečka představuje biologickou repliku.d Reprezentativní detekce a kvantifikace PDPL pomocí optimalizované sondy 3 v přítomnosti nebo nepřítomnosti uvedených složek PDPL, jako je c.n = 3 biologicky nezávislé vzorky.Každá tečka představuje biologickou repliku.Středové linie a vousy představují průměr a ± standardní odchylku.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Konfokální zobrazení singletového kyslíku s daleko červenou barvou Si-DMA.Měřítko: 10 µm.Gelové zobrazování a konfokální experimenty byly nezávisle opakovány alespoň dvakrát s podobnými výsledky.
Nejprve jsme testovali schopnost zralých fotosenzitizérů miniSOG26 a KillerRed23, stabilně exprimovaných v HEK293T, zprostředkovat propargylaminové značení proteomu jako chemickou sondu (doplňkový obrázek 1a).Gelová fluorescenční analýza ukázala, že značení celého proteomu bylo dosaženo pomocí miniSOG a ozáření modrým světlem, zatímco u KillerRed nebyl pozorován žádný produkt viditelného značení.Pro zlepšení poměru signálu k pozadí jsme poté testovali sadu chemických sond obsahujících anilin (1 a 3), propylamin (2) nebo benzylamin (4).Pozorovali jsme, že samotné buňky HEK293T měly vyšší signál pozadí ve srovnání s žádným modrým světlem, pravděpodobně kvůli endogennímu fotosenzibilizátoru riboflavinu, flavinmononukleotidu (FMN)27. Chemické sondy 1 a 3 na bázi anilinu poskytly lepší specificitu, přičemž HEK293T stabilně exprimující miniSOG v mitochondriích vykazoval >8násobný nárůst signálu pro sondu 3, zatímco sonda 2 použitá v metodě značení RNA CAP-seq vykazovala pouze ~2,5- násobné zvýšení signálu, pravděpodobně v důsledku různých preferencí reaktivity mezi RNA a proteinem (obr. 1b, c). Chemické sondy 1 a 3 na bázi anilinu poskytly lepší specificitu, přičemž HEK293T stabilně exprimující miniSOG v mitochondriích vykazoval >8násobný nárůst signálu pro sondu 3, zatímco sonda 2 použitá v metodě značení RNA CAP-seq vykazovala pouze ~2,5- násobné zvýšení signálu, pravděpodobně v důsledku různých preferencí reaktivity mezi RNA a proteinem (obr. 1b, c).Chemické sondy 1 a 3 na bázi anilinu vykazovaly lepší specificitu: HEK293T, který stabilně exprimuje miniSOG v mitochondriích, vykazuje více než 8násobný nárůst signálu pro sondu 3, zatímco sonda 2, používaná v metodě značení RNA CAP-seq, pouze ukazuje ~2,5-násobný nárůst signálu, pravděpodobně v důsledku různých preferencí reaktivity mezi RNA a proteinem (obr. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， HEK293T 在 线 中 稳定 表达 MINISOG ， 探针 3 的 信号 增加 增加 增加 倍 ， 而 用 于 于 于 于 方法 方法 的 的 探针 仅 显示 显示 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， HEK293T 在 中 稳定 表达 MINISOG ， 探针 3 的 信号 增加 增加 增加 增加 增加 增加 增加 增加 而 而 于 于 RNA 标记 CAP-EQ 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAChemické sondy 1 a 3 na bázi anilinu měly lepší specificitu, HEK293T stabilně exprimoval miniSOG v mitochondriích a sonda 3 měla více než 8násobný nárůst signálu, zatímco sonda 2 pro metodu značení CAP-seq RNA vykazovala pouze ~2,5násobné zvýšení.v signálu, pravděpodobně v důsledku rozdílných reakčních preferencí mezi RNA a proteinem (obr. 1b, c).Kromě toho byly testovány izomery sondy 3 a hydrazinové sondy (sondy 5, 6, 7), což potvrzuje optimalizaci sondy 3 (doplňkový obrázek 1b, c).Podobně fluorescenční analýza v gelu odhalila další optimalizované experimentální parametry: vlnová délka ozařování (460 nm), koncentrace chemické sondy (1 mM) a doba ozařování (20 min) (doplňkový obr. 2a–c).Vynechání jakékoli složky nebo kroku v protokolu PDPL vedlo k významnému obrácení signálu na pozadí (obr. 1d).Je pozoruhodné, že značení proteinů bylo významně sníženo v přítomnosti azidu sodného nebo troloxu, o kterých je známo, že zháší singletový kyslík.Přítomnost D2O, o kterém je známo, že stabilizuje singletový kyslík, zesiluje signál značení.Ke zkoumání příspěvku jiných reaktivních kyslíkových látek ke značení byly přidány mannitol a vitamín C, aby se vytvořily lapače hydroxylových a superoxidových radikálů, 18, 29, ale nebylo zjištěno, že by snižovaly značení.Přidání H2O2, ale ne osvětlení, nevedlo ke značení (doplňkový obr. 3a).Fluorescenční zobrazování singletového kyslíku pomocí Si-DMA sond potvrdilo přítomnost singletového kyslíku v drátu HEK293T-miniSOG, ale ne v původním drátu HEK293T.Navíc mitoSOX Red nemohl detekovat produkci superoxidu po osvícení (obr. 1e a doplňkový obr. 3b) 30. Tyto údaje silně naznačují, že singletový kyslík je hlavní reaktivní forma kyslíku zodpovědná za následné proteomické značení.Cytotoxicita PDPL byla hodnocena včetně ozařování modrým světlem a chemických sond a nebyla pozorována žádná významná cytotoxicita (doplňkový obr. 4a).
Abychom mohli studovat mechanismus značení a umožnit proteomickou identifikaci proteinových komplexů pomocí LC-MS/MS, musíme nejprve určit, které aminokyseliny jsou modifikovány, a delta hmotnost značek sond.Bylo popsáno, že methionin, histidin, tryptofan a tyrosin jsou modifikovány singletovým kyslíkem14,15.Integrujeme pracovní postup TOP-ABPP31 s nezaujatým otevřeným vyhledáváním, které poskytuje výpočetní platforma FragPipe založená na MSFragger32.Po modifikaci singletového kyslíku a chemickém značení sondou byla provedena click chemie s použitím biotinového redukčního značení obsahujícího štěpitelný linker, po kterém následovalo natažení neutravidinu a štěpení trypsinem.Modifikovaný peptid, stále navázaný na pryskyřici, byl fotoštěpen pro analýzu LC-MS/MS (obrázek 2a a doplňková data 1).V celém proteomu došlo k velkému počtu modifikací s více než 50 uvedenými shodami s peptidovou mapou (PSM) (obr. 2b).Překvapivě jsme pozorovali pouze modifikaci histidinu, pravděpodobně v důsledku vyšší reaktivity oxidovaného histidinu vůči anilinovým sondám než u jiných aminokyselin.Podle publikovaného mechanismu oxidace histidinu singletovým kyslíkem21,33 navrhovaná delta-hmotnostní struktura +229 Da odpovídá aduktu sondy 3 s 2-oxo-histidinem po dvou oxidacích, zatímco +247 Da je produkt hydrolýzy +229 Da (doplňkový obr. 5).Vyhodnocení spektra MS2 ukázalo vysokou spolehlivost identifikace většiny iontů y a b, včetně identifikace modifikovaných fragmentových iontů (y a b) (obr. 2c).Kontextová analýza lokální sekvence PDPL-modifikovaných histidinů odhalila mírnou motivovou preferenci pro malé hydrofobní zbytky v ±1 polohách (doplňkový obrázek 4b).V průměru bylo identifikováno 1,4 histidinů na protein a místa těchto markerů byla určena analýzou povrchové plochy přístupné rozpouštědlu (SASA) a relativní dostupnosti rozpouštědla (RSA) (doplňkový obrázek 4c, d).
Nezaujatý pracovní postup pro studium zbytkové selektivity pomocí výpočetní platformy FragPipe poháněné MSFragger.Štěpitelné linkery se používají v Click chemii, aby se umožnilo fotoštěpení modifikovaných peptidů ze streptavidinové pryskyřice.Bylo zahájeno otevřené vyhledávání s cílem identifikovat četné modifikace a také relevantní zbytky.b Přiřaďte množství modifikací vyskytujících se v proteomu.Peptidové mapování PSM.c MS2 spektrální anotace histidinových míst modifikovaných sondou 3. Jako reprezentativní příklad kovalentní reakce se sondou 3 přidala +229,0938 Da k modifikované aminokyselině.d Test mutací používaný k testování markerů PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) a PRDX1 (H10A, H81A, H169A) byly transfekovány plazmidy divokého typu pro detekci anti-Flag.e Syntetický peptid reagoval s purifikovaným miniSOG v přítomnosti sondy 3 a odpovídající produkty s AM +247 a +229 byly zaznamenány ve spektru LC-MS.f In vitro interakce protein-protein modelované s miniSOG-6xHis-tag a anti-6xHis protilátkou.Antibiotin (streptavidin-HRP) a anti-myší Western blot analýza miniSOG-6xHis/anti-6xHis protilátkových komplexů značených sondou 3, v závislosti na době expozice světlu.Značky pro jednotlivé proteiny jsou vyjádřeny v odpovídající molekulové hmotnosti: lehký řetězec protilátky LC, těžký řetězec protilátky HC.Tyto experimenty byly nezávisle opakovány alespoň dvakrát s podobnými výsledky.
Pro biochemické ověření místa značení byly PRDX3 a PRDX1 identifikované hmotnostní spektrometrií změněny z histidinu na alanin a porovnány s divokým typem v transfekčních testech.Výsledky PDPL ukázaly, že mutace významně snížila značení (obr. 2d).Mezitím byly syntetizovány peptidové sekvence identifikované v otevřeném vyhledávání a reagovaly in vitro s purifikovaným miniSOG v přítomnosti sondy 3 a modrého světla, čímž byly získány produkty s hmotnostním posunem +247 a +229 Da, když byly detekovány pomocí LC-MS (obr. 2e).).Abychom otestovali, zda mohou být interagující proximální proteiny značeny in vitro v reakci na fotoaktivaci miniSOG, navrhli jsme test umělé blízkosti interakcí mezi proteinem miniSOG-6xHis a anti-His monoklonální protilátkou in vitro (obrázek 2f).V tomto testu jsme očekávali proximální značení těžkých a lehkých řetězců protilátky pomocí miniSOG.Western bloty proti myším (rozpoznávajícím těžké a lehké řetězce protilátky značené anti-6xHis) a streptavidinu ukázaly silnou biotinylaci těžkých a lehkých řetězců.Pozoruhodně jsme zaznamenali autobiotinylaci miniSOG díky značce 6xHis a křížovým vazbám mezi lehkými a těžkými řetězci, což může souviset s dříve popsanou mezerou mezi proximální odpovědí lysinu a 2-oxo-histidinu.Závěrem jsme dospěli k závěru, že PDPL modifikuje histidin způsobem závislým na blízkosti.
Naším dalším cílem bylo charakterizovat subcelulární proteom pro testování specificity značení in situ.Proto jsme stabilně exprimovali miniSOG v jádře, mitochondriální matrici nebo vnější membráně ER buněk HEK293T (obr. 3a).Gelová fluorescenční analýza odhalila hojné značené pásy na třech subcelulárních místech a také různé vzory značení (obr. 3b).Fluorescenční zobrazovací analýza ukázala vysokou specificitu PDPL (obr. 3c).Po pracovním postupu PDPL následovaly klikací reakce s rhodaminovými barvivy k vymezení subcelulárních proteomů pomocí fluorescenční mikroskopie a signály PDPL byly kolokalizovány pomocí DAPI, mitochondriálních sledovačů nebo sledovačů ER, což potvrdilo vysokou věrnost PDPL.Pokud jde o tři umístění organel, srovnání PDPL s TurboID vedle sebe pomocí avidinového western blotu ukázalo, že PDPL byl značen konkrétněji ve srovnání s jejich příslušnými kontrolami.Za podmínek PDPL se objevilo více značených pásů, což naznačuje více proteinů značených PDPL (doplňkový obrázek 6a-d).
Schematické znázornění značení proteomu specifického pro organely zprostředkované miniSOG.miniSOG se zaměřuje na mitochondriální matrici prostřednictvím fúze s N-koncovými 23 aminokyselinami lidského COX4 (mito-miniSOG), jádro prostřednictvím fúze s H2B (nucleus-miniSOG) a Sec61β přes cytoplazmatickou stranu membrány ER (ER-miniSOG ).Indikace zahrnují gelové zobrazení, konfokální zobrazení a hmotnostní spektrometrii.b Reprezentativní gelové snímky tří profilů PDPL specifických pro organely.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Reprezentativní konfokální obrazy buněk HEK293T stabilně exprimujících miniSOG s různými subcelulárními lokalizacemi detekovanými protilátkou značenou V5 (červená).Subcelulární markery se používají pro mitochondrie a ER (zelená).Pracovní postup PDPL zahrnuje detekci miniSOG (žlutě) značených subcelulárních proteomů pomocí Cy3-azidové klikací chemie.Měřítko: 10 µm.d Vulkanické grafy proteomů značených PDPL v různých organelách kvantifikovaných neznačenou kvantifikací (n = 3 nezávislé biologické experimenty).Na sopečných plochách byl použit dvoustranný Studentův t-test.Divoký typ HEK293T byl použit jako negativní kontrola. Významně změněné proteiny jsou zvýrazněny červeně (p < 0,05 a > 2násobný rozdíl v intenzitě iontů). Významně změněné proteiny jsou zvýrazněny červeně (p < 0,05 a > 2násobný rozdíl v intenzitě iontů). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 a >2-кратная разнтица вовиннина). Významně změněné proteiny jsou zvýrazněny červeně (p < 0,05 a > 2násobný rozdíl v intenzitě iontů).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 a > 2-кратная разнициой в ). Významně změněné proteiny jsou zvýrazněny červeně (p < 0,05 a > 2násobný rozdíl v iontové síle).Související proteiny důležité pro HEK293T-miniSOG, ale nedůležité pro HEK293T, jsou zobrazeny zeleně.e Analýza specifičnosti souborů proteomických dat z experimentů d.Celkový počet statisticky významných proteinů v každé organele (červené a zelené tečky) je označen nahoře.Histogramy ukazují proteiny lokalizované v organelách na základě MitoCarta 3.0, GO analýzy a A. Tinga a kol.lidé.Samostatné datové sady pro mitochondrie, jádra a ER.Tyto experimenty byly nezávisle opakovány alespoň dvakrát s podobnými výsledky.Nezpracovaná data jsou poskytována ve formě souborů nezpracovaných dat.
Povzbuzeni výsledky gelu a zobrazování byla ke kvantifikaci identifikovaného proteomu v každé organele použita kvantifikace bez označení (doplňková data 2).Netransfekovaný HEK293T byl použit jako negativní kontrola k odečtení markerů pozadí. Analýza sopečného grafu ukázala významně obohacené proteiny (p < 0,05 a > 2-násobek intenzity iontů), stejně jako proteiny singleton, které jsou přítomny pouze v liniích exprimujících miniSOG (obr. 3d červené a zelené tečky). Analýza sopečného grafu ukázala významně obohacené proteiny (p < 0,05 a > 2-násobek intenzity iontů), stejně jako proteiny singleton, které jsou přítomny pouze v liniích exprimujících miniSOG (obr. 3d červené a zelené tečky). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Analýza sopečného grafu ukázala významně obohacené proteiny (p<0,05 a >2násobek iontové intenzity), stejně jako jednotlivé proteiny, které jsou přítomny pouze v miniSOG-exprimujících liniích (obr. 3d, červené a zelené tečky).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （P <0,05 和> 2 倍 离子）） 仅 在于 在于 表达 系 中 的 单一 （图 图 图 图 绿色点）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。）））））））））））））））））））））））火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （P <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点 。。。））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Analýza sopečného grafu odhalila významně obohacené proteiny (p<0,05 a >2x iontová síla) a také jednotlivé proteiny přítomné pouze v expresní linii miniSOG (červené a zelené tečky na obr. 3d).Kombinací těchto dat jsme identifikovali 1364, 461 a 911 statisticky významných jaderných, mitochondriálních a ER proteinů vnější membrány, v daném pořadí.K analýze přesnosti PDPL lokalizovaného v organelách jsme použili MitoCarta 3.0, analýzu genové ontologie (GO) a A. Ting et al.soubor dat8 byl použit pro mitochondrie, jádro a ER k testování organelové specificity detekovaných proteinů, což odpovídá přesnosti 73,4, 78,5 a 73,0 % (obr. 3e).Specifičnost PDPL potvrzuje, že PDPL je ideálním nástrojem pro identifikaci proteomů specifických pro organely.Předložená analýza identifikovaných mitochondriálních proteinů zejména ukázala, že zachycený proteom byl distribuován hlavně v matrici a vnitřní membráně (226 a 106, v tomto pořadí), což představuje 91,7 % (362) z celkového počtu identifikovaných mitochondriálních proteinů.byla dodatečně potvrzena vysoká hladina PDPL (doplňkový obr. 7a).Podobně subnukleární analýza ukázala, že zachycený proteom byl distribuován hlavně v jádře, nukleoplazmě a jadérku (doplňkový obrázek 7b).Nukleární proteomická analýza se signálním peptidem pro jadernou lokalizaci (3xNLS) ukázala podobnou přesnost jako konstrukt H2B (doplňkový obrázek 7c–h).Pro stanovení specificity PDPL markeru byl vybrán jaderný laminin A jako diskrétněji lokalizovaný blok POI7.PDPL identifikovalo 36 významně obohacených proteinů, z nichž 12 proteinů (30,0 % včetně laminu A) byly dobře charakterizované proteiny interagující s laminem A anotované v databázi String, s vyšším procentem než u metody BioID (122 proteinů) 28 z 28. , 22.9 %) 7. Naše metoda identifikovala méně proteinů, pravděpodobně kvůli omezeným oblastem značení, což bylo umožněno aktivnějším singletovým kyslíkem.GO analýza ukázala, že identifikované proteiny byly umístěny hlavně v nukleoplazmě (26), jaderné membráně (10), jaderné membráně (9) a jaderných pórech (5).Souhrnně tyto proteiny lokalizované v jádře představovaly 80 % obohacených proteinů, což dále prokazuje specifičnost PDPL (doplňkový obr. 8a–d).
Po zjištění schopnosti PDPL provádět značení blízkosti v organelách jsme poté testovali, zda lze PDPL použít k analýze vazebných partnerů POI.Zejména jsme se snažili definovat PDPL analýzu cytosolických proteinů, které jsou považovány za obtížnější cíle než jejich membránově lokalizované protějšky kvůli jejich vysoce dynamické povaze.Bromodoména a extraterminální (BET) protein BRD4 upoutal naši pozornost pro svou klíčovou roli v různých onemocněních 35, 36 .Komplex tvořený BRD4 je transkripční koaktivátor a důležitý terapeutický cíl.Regulací exprese transkripčních faktorů c-myc a Wnt5a se BRD4 považuje za klíčový determinant akutní myeloidní leukémie (AML), mnohočetného myelomu, Burkittova lymfomu, rakoviny tlustého střeva a zánětlivých onemocnění37,38.Některé viry se navíc zaměřují na BRD4, aby regulovaly virovou a buněčnou transkripci, jako je papilomavirus, HIV a SARS-CoV-236,39.
Pro mapování interakce BRD4 pomocí PDPL jsme zkombinovali miniSOG s krátkou N- nebo C-koncovou izoformou BRD4.Proteomické výsledky odhalily vysoký stupeň překrývání mezi dvěma konstrukty (doplňkový obr. 9a).Jaderný proteom identifikovaný pomocí miniSOG-H2B pokrývá 77,6 % proteinů interagujících s BRD4 (doplňkový obrázek 9b).Poté byly použity různé doby osvětlení (2, 5, 10, 20 min) k úpravě poloměru markeru (obr. 4a a doplňková data 3).Došli jsme k závěru, že při kratších fotoperiodách bude PDPL primárně označovat přímé vazebné partnery, zatímco delší období bude zahrnovat proteiny identifikované během kratších období fotoaktivace, stejně jako nepřímé cíle ve značkovacích komplexech.Ve skutečnosti jsme našli silné překrývání mezi sousedními časovými body (84,6 % pro 2 a 5 min; 87,7 % pro 5 a 10 min; 98,7 % pro 10 a 20 min) (obr. 4b a doplňkový obr. 9c).Ve všech experimentálních skupinách jsme našli nejen samooznačení BRD4, ale několik známých cílů jako MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A a HMGB1 anotovaných v databázi řetězců.Iontová síla těchto cílů je úměrná době expozice (obr. 4c a doplňkový obr. 9d).GO analýza proteinů identifikovaných ve 2minutové skupině ukázala, že identifikované proteiny byly lokalizovány v jádře a podílely se na remodelaci chromatinu a funkci RNA polymerázy.Molekulární funkce proteinu byla obohacena o vazbu chromatinu nebo koaktivaci transkripce, což je v souladu s funkcí BRD4 (obr. 4d).Analýza proteinových interakcí s databází řetězců odhalila první úroveň nepřímých interakcí mezi interagujícími komplexy rodiny BRD4 a HDAC, jako jsou SIN3A, NCOR2, BCOR a SAP130 (obr. 4e a doplňkový obr. 9e), v souladu s acetylovanými histony vázajícími BRD4 a HDAC ..Kromě toho byly pomocí Western blotu potvrzeny reprezentativní cíle identifikované pomocí LC-MS/MS, včetně Sin3A, NSUN2, Fus a SFPQ (obr. 4f).Nedávno bylo hlášeno, že krátká izoforma BRD4 tvoří jádra s vlastnostmi separace fáze kapalina-kapalina (LLPS).Proteiny vázající RNA Fus a SFPQ zprostředkovávají LLPS různých buněčných procesů a byly zde identifikovány jako nezaznamenané proteiny vázající BRD4.Interakce mezi BRD4 a SFPQ byla potvrzena koimunoprecipitačními (co-IP) experimenty (obrázek 4g), což naznačuje další mechanismus pro separaci fáze kapalina-kapalina zprostředkovanou BRD4, který si zaslouží další zkoumání.Dohromady tyto výsledky naznačují, že PDPL je ideální platforma pro identifikaci známých BRD4 interagujících i neznámých vazebných proteinů.
a Schematické znázornění přiblížení BRD4 zprostředkovaného miniSOG, expoziční časy: 2, 5, 10 a 20 min.b Překrývání proteinů identifikovaných při různých dobách osvětlení.Proteinové obohacení identifikované v HEK293T-miniSOG-BRD4 bylo statisticky významné ve srovnání s divokým typem HEK293T.c Iontová intenzita při kvantifikaci neznačených reprezentativních známých proteinů vázajících BRD4 během specifikované doby expozice.n = 3 biologicky nezávislé vzorky.Data jsou prezentována jako průměr ± standardní odchylka.d Genová ontologická analýza (GO) proteinů identifikovaných ve 2minutové skupině.Je uvedeno prvních deset termínů GO.Bubliny jsou zbarveny podle kategorie termínu GO a velikost bublin je úměrná počtu proteinů nalezených v každém termínu.e Řetězcová analýza proteinů interagujících s BRD4.Žluté kruhy jsou přímé lepidlo a šedé kruhy jsou první vrstvou nepřímého lepidla.Červené čáry představují experimentálně stanovené interakce a modré čáry představují předpokládané interakce.f Reprezentativní BRD4 vazebné cíle identifikované v LC-MS/MS byly ověřeny Western blotem.g Koimunoprecipitační experimenty potvrzují interakci mezi SFPQ a BRD4.Tyto experimenty byly nezávisle opakovány alespoň dvakrát s podobnými výsledky.Nezpracovaná data jsou poskytována ve formě souborů nezpracovaných dat.
Kromě identifikace neregistrovaných cílů spojených s POI předpokládáme, že PDPL bude vhodný pro identifikaci substrátů pro enzymy, což by vyžadovalo charakterizaci nepřímých vazebných proteinů ve velkých komplexech pro anotaci neregistrovaných substrátů.Parkin (kódovaný PARK2) je ligáza E3 a je známo, že mutace v parkinu způsobují autozomálně recesivní juvenilní Parkinsonovu nemoc (AR-JP)42.Kromě toho byl parkin popsán jako nezbytný pro mitofágii (mitochondriální autofagii) a odstraňování reaktivních forem kyslíku.Přestože bylo identifikováno několik parkinových substrátů, role parkinu u tohoto onemocnění zůstává nejasná.Pro anotaci jeho necharakterizovaných substrátů byl PDPL testován přidáním miniSOG na N- nebo C-konec parkinu.Buňky byly ošetřeny karbonylkyanidovým protonovým transportérem m-chlorfenylhydrazonem (CCCP), aby se aktivoval parkin prostřednictvím PINK1-Parkinovy dráhy.Ve srovnání s našimi výsledky BRD4 PDPL odhalila fúze parkin N-konce větší soubor cílových proteinů, i když pokrývala větší část C-konce (177 z 210) (obrázek 5a,b a doplňková data 4).výsledek je v souladu se zprávami, že N-terminální značky mohou aberantně aktivovat Parkin44.Překvapivě bylo v našich datech pouze 18 překrývajících se proteinů s publikovanými výsledky AP-MS pro Parkin43, pravděpodobně kvůli rozdílům mezi buněčnými liniemi a proteomickými pracovními postupy.Kromě čtyř známých proteinů (ARDM1, HSPA8, PSMD14 a PSMC3) identifikovaných dvěma metodami (obr. 5c)43.K dalšímu ověření výsledků LC-MS/MS bylo použito ošetření PDPL a následný Western blotting k porovnání výsledků testu na rodičovských buňkách HEK293T a stabilní N-terminální parkinové linie.Dříve neznámé cíle CDK2, DUT, CTBP1 a PSMC4 byly testovány se známým pojivem DNAJB1 (obr. 5d).
Sopečný graf proteinů interagujících s parkinem v buňkách HEK293T se stabilně exprimovaným miniSOG fúzovaným k N- nebo C-konci parkinu (n = 3 nezávislé biologické experimenty).Na sopečných plochách byl použit dvoustranný Studentův t-test.HEK293T byl použit jako negativní kontrola. Významně změněné proteiny jsou zvýrazněny červeně (p < 0,05 a > 2násobný rozdíl v intenzitě iontů). Významně změněné proteiny jsou zvýrazněny červeně (p < 0,05 a > 2násobný rozdíl v intenzitě iontů). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 a >2-кратная разнтица вовиннина). Významně změněné proteiny jsou zvýrazněny červeně (p < 0,05 a > 2násobný rozdíl v intenzitě iontů).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 a > 2-кратная разнициой в ). Významně změněné proteiny jsou zvýrazněny červeně (p < 0,05 a > 2násobný rozdíl v iontové síle).Související proteiny důležité pro HEK293T-miniSOG, ale nedůležité pro HEK293T, jsou zobrazeny zeleně.b Vennův diagram ukazující překrývající se proteiny mezi N-koncovými a C-koncovými konstrukty.N-terminální značky mohou aberantně aktivovat parkin a vést k lépe rozpoznatelným proteinům.c Vennův diagram ukazující překrývající se proteiny mezi PDPL a AP-MS.Jsou uvedeny známé interaktory, včetně 4 z 18 překrývajících se proteinů a 11 ze 159 proteinů specificky identifikovaných v PDPL.d Reprezentativní cíle identifikované pomocí LC-MS/MS byly ověřeny Western blotem.e Ssu72 a SNW1 byly identifikovány jako neregistrované parkinové substráty.Tyto proteinové plazmidy značené FLAG byly transfekovány do HEK293T a HEK293T-Parkin-miniSOG, po čemž následovalo ošetření CCCP v různých časových bodech.Degradace byla výraznější u linie Parkinovy nadměrné exprese.f Použitím inhibitoru proteazomu MG132 bylo potvrzeno, že proces degradace Ssu72 a SNW1 je zprostředkován ubikvitinací proteazomu.Tyto experimenty byly nezávisle opakovány alespoň dvakrát s podobnými výsledky.Nezpracovaná data jsou poskytována ve formě souborů nezpracovaných dat.
Je pozoruhodné, že proteiny identifikované pomocí PDPL musí zahrnovat proteiny vázající parkin a jejich substráty.Pro detekci neregistrovaných parkinových substrátů jsme vybrali sedm identifikovaných proteinů (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 a SNW1) a transfekované plazmidy, abychom tyto geny vystavili normálnímu HEK293T a stabilně exprimovali miniSOG-Parkin's HEK293T a následně léčbu HEKCCCP.Hladiny proteinů Ssu72 a SNW1 byly významně sníženy u stabilní linie miniSOG-Parkin (obr. 5e).Ošetření CCCP po dobu 12 hodin vedlo k nejvýznamnější degradaci obou substrátů.Abychom prozkoumali, zda je degradace Ssu72 a SNW1 regulována ubikvitinací proteazomu, byl přidán inhibitor proteazomu MG132, aby se inhibovala aktivita proteazomu, a ve skutečnosti jsme zjistili, že jejich degradační proces byl inhibován (obr. 5f).Další nesubstrátové cíle byly potvrzeny jako Parkinovy interaktory pomocí Western blottingu (doplňkový obr. 10), které vykazovaly konzistentní výsledky s LC-MS/MS.Závěrem lze říci, že integrace pracovního postupu PDPL s ověřením transfekce cílového proteinu umožňuje identifikaci neregistrovaných substrátů E3 ligázy.
Vyvinuli jsme společnou platformu pro značení blízkosti, která vám umožňuje identifikovat v prostoru a čase interagující POI.Platforma je založena na proteinu fotosenzibilizátoru miniSOG, který má pouze asi 12 kDa, což je méně než polovina velikosti zralého enzymu APEX2 (27 kDa) a jedna třetina velikosti TurboID (35 kDa).Menší velikost by měla výrazně rozšířit rozsah aplikací pro studium malých proteinových interaktomů.Pro zvýšení kvantového výtěžku singletového kyslíku a rozšíření citlivosti tohoto přístupu je zapotřebí další průzkum dalších fotosenzibilizátorů, ať už jde o geneticky kódované proteiny nebo malé molekuly.U aktuální verze miniSOG lze dosáhnout vysokého časového rozlišení pomocí modrého osvětlení pro aktivaci značek přiblížení.Delší expoziční čas navíc uvolnil větší „oblak“ singletového kyslíku, což má za následek modifikaci více distálních histidinových zbytků, zvýšený poloměr značení a možnost doladit prostorové rozlišení PDPL.Také jsme testovali sedm chemických sond pro zvýšení poměru signálu k pozadí a prozkoumali jsme molekulární mechanismus za tímto přístupem.Pracovní postup TOP-ABPP v kombinaci s nezaujatým otevřeným vyhledáváním potvrdil, že k modifikacím došlo pouze u histidinů a nebylo pozorováno žádné konzistentní mikroprostředí pro zvýšené histidinové modifikace, s výjimkou střední preference histidinů v oblasti smyčky.
PDPL byl také použit k charakterizaci subcelulárních proteomů s proteomovou specifitou a pokrytím přinejmenším srovnatelným s jinými metodami proximitního značení a organelově specifických chemických sond.Proximitní markery byly také úspěšně použity k charakterizaci povrchových, lysozomálních a se sekretomem spojených proteomů46,47.Věříme, že PDPL bude kompatibilní s těmito subcelulárními organelami.Kromě toho jsme zpochybnili PDPL identifikací cílů pro vazbu cytosolových proteinů, které jsou složitější než proteiny vázané na membránu kvůli jejich dynamickým vlastnostem a zapojení do dočasnějších interakcí.PDPL byl aplikován na dva proteiny, transkripční koaktivátor BRD4 a s onemocněním asociovanou ligázu E3 Parkin.Tyto dva proteiny byly vybrány nejen pro jejich základní biologické funkce, ale také pro jejich klinický význam a terapeutický potenciál.U těchto dvou POI byli identifikováni dobře známí vazební partneři i neregistrované cíle.Je pozoruhodné, že protein SFPQ spojený s fázovou separací byl potvrzen ko-IP, což může naznačovat nový mechanismus, kterým BRD4 (krátká izoforma) reguluje LLPS.Zároveň se domníváme, že identifikace substrátů Parkin je scénář, ve kterém je vyžadována identifikace nepřímých lepidel.Identifikovali jsme dva neidentifikované parkinové substráty a potvrdili jejich degradaci podél ubikvitinace-proteazomové dráhy.Nedávno byla vyvinuta strategie zachycování založená na mechanismu pro detekci hydrolázových substrátů jejich zachycením pomocí enzymů.Přestože se jedná o velmi výkonnou metodu, není vhodná pro analýzu substrátů podílejících se na tvorbě velkých komplexů a vyžaduje vytvoření kovalentních vazeb mezi enzymem a substrátem.Očekáváme, že PDPL lze rozšířit o studium dalších proteinových komplexů a rodin enzymů, jako jsou rodiny deubikvitináz a metaloproteáz.
Byla vyvinuta nová forma miniSOG, nazvaná SOPP3, se zlepšenou produkcí singletového kyslíku.Porovnali jsme miniSOG s SOPP3 a zjistili jsme zlepšený výkon značení, i když poměr signálu k šumu zůstal nezměněn (doplňkový obrázek 11).Předpokládali jsme, že optimalizace SOPP3 (např. prostřednictvím řízené evoluce) povede k účinnějším fotosenzibilizačním proteinům, které vyžadují kratší světelné časy, a tak umožní zachycení dynamičtějších buněčných procesů.Je pozoruhodné, že současná verze PDPL je omezena na buněčné prostředí, protože vyžaduje osvětlení modrým světlem a nemůže proniknout do hlubokých tkání.Tato vlastnost vylučuje jeho použití ve studiích na zvířecích modelech.Kombinace optogenetiky s PDPL by však mohla poskytnout příležitost pro výzkum na zvířatech, zejména v mozku.Toto omezení navíc odstraňují i jiné upravené infračervené fotosenzitizéry.V současné době v této oblasti probíhá výzkum.
Buněčná linie HEK293T byla získána od ATCC (CRL-3216).Buněčná linie byla testována negativně na mykoplazmatickou infekci a byla kultivována v DMEM (Thermo, #C11995500BT) doplněném 10% fetálním bovinním sérem (FBS, Vistech, #SE100-B) a 1% penicilinem/streptomycinem (Hyclone, #SV30010).vyrostl v.
3-Aminofenylen (vzorek 3) a (4-ethynylfenyl)methanamin (vzorek 4) byly zakoupeny od Bidepharm.Propylamin (sonda 2) byl zakoupen od Energy-chemicals.N-(2-Aminofenyl)pent-4-ynamid (sonda 1) byl syntetizován podle publikovaných metod.
Doplňková tabulka 1 uvádí genetické konstrukty použité v této studii.Sekvence miniSOG a KillerRed byly klonovány z dárkového plazmidu od P. Zou (Peking University).Sekvence cílení na mitochondriální matrici byla odvozena z 23 N-koncových aminokyselin COX4 a klonována do uvedených vektorů pomocí sestavy Gibson (Beyotime, #D7010S).K cílení na membránu a jádro endoplazmatického retikula byla použita lidská DNA SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplifikovaná pomocí PCR z knihovny cDNA buněk HEK293T a DNA H2B (darováno D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) a klonováno, jak je uvedeno výše.Pokud není uvedeno jinak, další proteinové geny použité pro transfekci a konstrukci stabilních buněčných linií byly amplifikovány PCR z knihovny cDNA buněk HEK293T.G3S (GGGS) a G4S (GGGGS) byly použity jako linkery mezi návnadovým proteinem a miniSOG.K těmto fúzním konstruktům byla přidána V5 epitopová značka (GKPIPNPLLGLDST).Pro expresi u savců a pro vytvoření stabilní buněčné linie byl miniSOG fúzní konstrukt subklonován do lentivirového vektoru pLX304.Pro bakteriální expresi byl miniSOG klonován do vektoru pET21a označeného 6xHis na C-konci.
Buňky HEK293T byly nasazeny v množství 2,0 x 105 buněk na jamku do šestijamkových destiček a o 24 hodin později transfekovány rekombinantními lentivirovými plazmidy (2,4 μg pLX304) a virovými balicími plazmidy (1,5 μg psPAX2 a 1,2 μg Lipo80 μg s p02 , #C0533), asi 80% fúze.Po transfekci přes noc bylo médium vyměněno a inkubováno dalších 24 hodin.Sběr viru byl proveden po 24, 48 a 72 hodinách.Před infekcí cílových buněčných linií bylo virové médium filtrováno přes 0,8 μm filtr (Merck, #millex-GP) a byl přidán polybren (Solarbio, #H8761) do koncentrace 8 μg/ml.Po 24 hodinách se buňky nechaly zotavit výměnou média.Buňky byly selektovány pomocí 5 ug/ml blasticidinu (Solarbio, #3513-03-9) pro první tři pasáže jako méně přísná selekce.Poté bylo použito 20 μg/ml jako přísnější režim pro další tři pasáže.
Buňky byly nasazeny do 12jamkových komůrek (Ibidi, #81201) v hustotě přibližně 20 000 buněk na jamku.Pro zlepšení adheze buněk HEK293T přidejte 50 ug/ml fibronektinu (Corning, #356008) zředěného ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS, Sangon, #B640435) při 37 °C.Komůrky byly předem ošetřeny po dobu 1 hodiny a poté odstraněny PBS.Po 24 hodinách byly buňky jednou promyty PBS, inkubovány s 1 mM sondou 3 v čerstvém Hanksově vyváženém solném roztoku (HBSS, Gibco, #14025092) po dobu 1 hodiny při 37 °C a poté inkubovány s modrou LED (460 nm ).) byly ozařovány po dobu 10 minut při teplotě místnosti.Poté byly buňky dvakrát promyty PBS a fixovány 4% formaldehydem v PBS (Sangon, #E672002) po dobu 15 minut při teplotě místnosti.Přebytek formaldehydu byl odstraněn z fixovaných buněk promytím třikrát PBS.Buňky byly poté permeabilizovány 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) v PBS a promyty 3krát PBS.Poté vyjměte komůrku a ke každému vzorku přidejte 25 µl klikací reakční směsi obsahující 50 uM Cy3-azid (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) a 0,5 mg/ml askorbátu sodného (Aladdin, č. S105024) a inkubovány po dobu 30 minut při teplotě místnosti.Po rychlé reakci byly buňky šestkrát promyty PBS obsahujícím 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) a poté blokovány 5% BSA (Abcone, #B24726) v PBST po dobu 30 minut při teplotě místnosti.
Pro kolokalizační imunobarvení byly buňky inkubovány s primárními protilátkami podle uvedených podmínek: myší anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), králičí anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABClonal, #A0564), králičí polyklonální anti-kalnexinová protilátka (1:500, Abcam, #ab22595) nebo králičí anti-lamin A/C monoklonální protilátka (1:500; CST, #2032) při 4 °C přes noc.Po trojnásobném promytí PBST byly buňky inkubovány se sekundárními protilátkami: kozí anti-králičí Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) zředěný 1:1000, kozí anti-myší Alexa Fluor 594 (CST, #8889) zředěný 1:1000.ředění Ředění při pokojové teplotě po dobu 30 minut.Buňky byly poté třikrát promyty PBST a kontrastně barveny DAPI (Thermo, #D1306) v PBS po dobu 10 minut při teplotě místnosti.Po 3 promytích PBS byly buňky za účelem zobrazení uzavřeny v 50% glycerolu (Sangon, #A600232) v PBS.Imunofluorescenční snímky byly získány pomocí konfokálního mikroskopu ZEISS LSM 900 Airyscan2 a softwaru ZNE 3.5.
Pro fluorescenční zobrazování singletovým kyslíkem byly buňky dvakrát promyty Hanksovým HEPES pufrem před přidáním 100 nM Si-DMA v Hanksově HEPES pufru (DOJINDO, #MT05).Po vystavení světlu byly buňky inkubovány v CO2 inkubátoru při 37 °C po dobu 45 minut.Buňky byly poté dvakrát promyty Hanksovým HEPES pufrem a kontrastně obarveny Hoechst v Hanksově HEPES pufru po dobu 10 minut při teplotě místnosti a vizualizovány pomocí konfokálního mikroskopu ZEISS LSM 900., #M36008) v HBSS pufru obsahujícím vápník a hořčík.Po vystavení světlu nebo doxorubicinu (MCE, #HY-15142A) byly buňky inkubovány v CO2 inkubátoru při 37 °C po dobu 10 minut, dvakrát promyty HBSS pufrem a inkubovány s Hoechst v HBSS pufru při teplotě místnosti.minut.Doxorubicin byl použit jako pozitivní kontrola sondy, kde byly buňky ošetřeny 20 uM doxorubicinem v HBSS obsahujícím 1% BSA po dobu 30 minut.Imunofluorescenční obrazy byly získány pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss LSM 900.
Buňky HEK293T stabilně exprimující mito-miniSOG byly nasazeny v hustotě přibližně 30 % do 15 cm misek.Po 48 hodinách, kdy bylo dosaženo ~80% konfluence, byly buňky jednou promyty PBS, inkubovány s 1 mM Probe 3 v čerstvém HBSS pufru po dobu 1 hodiny při 37 °C a poté osvětleny modrou LED po dobu 10 minut při pokojové teplotě. teplota..Poté byly buňky dvakrát promyty PBS, seškrábány a resuspendovány v ledově chladném PBS pufru obsahujícím inhibitory proteázy bez EDTA (MCE, #HY-K0011).Buňky byly lyžovány sonikací špičky po dobu 1 minuty (1 sekunda zapnuta a 1 sekunda vypnuta při 35% amplitudě).Výsledná směs byla odstřeďována při 15 871 xg po dobu 10 minut při 4 °C, aby se odstranily zbytky, a koncentrace supernatantu byla upravena na 4 mg/ml pomocí soupravy pro analýzu proteinů BCA (Beyotime, #P0009).Smíchejte 1 ml výše uvedeného lyzátu s 0,1 mM fotodegradabilním biotin azidem (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM ligandem TBTA (Aladdin, #T162437) a 1 mM inkubátoru s CuSO4 otáčejte po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě.Po rychlé reakci přidejte směs k předem smíchanému roztoku (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) v 10ml skleněné lahvičce.Vzorky byly smíchány a centrifugovány při 4500 g po dobu 10 minut při teplotě místnosti.Spodní a horní roztoky byly odstraněny, sraženina byla dvakrát promyta 1 ml methanolu a centrifugována při 15 871 x g po dobu 5 minut při 4 °C.Přidejte 1 ml 8 M močoviny (Aladdin, č. U111902) v 25 mM hydrogenuhličitanu amonném (ABC, Aladdin, č. A110539), aby se sraženina rozpustila.Vzorky byly rekonstituovány s 10 mM dithiothreitolem (Sangon, č. A100281 v 25 mM ABC) po dobu 40 minut při 55 °C, poté bylo přidáno 15 mM čerstvého jodacetamidu (Sangon, č. A600539) při teplotě místnosti ve tmě.Alkylace do 30 minut..K zastavení reakce bylo přidáno dalších 5 mM dithiothreitolu.Připravte přibližně 100 µl agarózových kuliček NeutrAvidin (Thermo, #29202) pro každý vzorek promytím 3x 1 ml PBS.Výše uvedený roztok proteomu byl zředěn 5 ml PBS a inkubován s předem promytými agarózovými kuličkami NeutrAvidin po dobu 4 hodin při teplotě místnosti.Kuličky byly poté promyty 3krát 5 ml PBS obsahujícím 0,2 % SDS (Sangon, #A600485), 3krát 5 ml PBS obsahujícího 1M močovinu a 3krát 5 ml ddH20.Kuličky byly poté sklizeny centrifugací a resuspendovány ve 200 ul 25 mM ABC obsahujícího 1 M močovinu, 1 mM CaCl2 (Macklin, #C805228) a 20 ng/ul trypsinu (Promega, #V5280).Trypsinizace přes noc při 37 °C s rotací.Reakce byla zastavena přidáním kyseliny mravenčí (Thermo, # A117-50), dokud pH nedosáhlo 2-3.Kuličky byly 3krát promyty 1 ml PBS obsahujícím 0,2 % SDS, 3krát 1 ml PBS obsahujícího 1 M močovinu a poté 3krát 1 ml destilované vody.Modifikované peptidy byly uvolněny světelnou lýzou (365 nm) po dobu 90 minut za použití 200 ul 70% MeOH.Po odstředění se shromáždil supernatant.Kuličky byly poté jednou promyty 100 ul 70% MeOH a supernatanty byly spojeny.Vzorky byly vysušeny ve vakuovém koncentrátoru Speedvac a skladovány při -20 °C až do analýzy.
Pro identifikaci a kvantifikaci peptidů modifikovaných singletovým kyslíkem byly vzorky znovu rozpuštěny v 0,1% kyselině mravenčí a 1 μg peptidů byl analyzován pomocí hmotnostního spektrometru Orbitrap Fusion Lumos Tribrid vybaveného nano ESI zdrojem od Tune a Xcalibur od dodavatele softwaru 4.3.Vzorky byly separovány na 75 um x 15 cm vnitřně plněné kapilární koloně s 3 um C18 materiálem (ReproSil-pur, #r13.b9.) a připojeny k systému EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Peptidy byly separovány lineární 95minutovou gradientovou chromatografií z 8% rozpouštědla B do 50% rozpouštědla B (A = 0,1% kyselina mravenčí ve vodě, B = 0,1% kyselina mravenčí v 80% acetonitrilu), poté lineárně zvýšena na 98% B min za 6 minut při průtoku 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos shromažďuje data střídavě mezi úplným skenováním MS a skenováním MS2 v závislosti na datech.Rozprašovací napětí bylo nastaveno na 2,1 kV a teplota iontové transportní kapiláry byla 320 °C.MS spektra (350-2000 m/z) byla sbírána s rozlišením 120 000, AGC 4 × 105 a maximální vstupní dobou 150 ms.10 nejběžnějších vícenásobně nabitých prekurzorů v každém úplném skenování bylo fragmentováno pomocí HCD s normalizovanou srážkovou energií 30 %, kvadrupólovým izolačním oknem 1,6 m/z a nastavením rozlišení 30 000.AGC cíl pro tandemovou hmotnostní spektrometrii využívající 5×104 a maximální vstupní čas 150 ms.Dynamická výjimka je nastavena na 30 sekund. Nepřiřazené ionty nebo ionty s nábojem 1+ a >7+ byly pro MS/MS odmítnuty. Nepřiřazené ionty nebo ionty s nábojem 1+ a >7+ byly pro MS/MS odmítnuty. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ a >7+ были отклонены для МС/МС. Nepřiřazené ionty nebo ionty s nábojem 1+ a >7+ byly pro MS/MS odmítnuty.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ a >7+ были отклонены для МС/МС. Nespecifikované ionty nebo ionty s nábojem 1+ a >7+ byly pro MS/MS odmítnuty.
Nezpracovaná data jsou zpracována pomocí výpočetní platformy FragPipe založené na MSFragger.Hmotnostní odchylky a odpovídající aminokyseliny byly stanoveny pomocí otevřeného vyhledávacího algoritmu s tolerancí hmotnosti prekurzoru -150 až 500 Da.Modifikované peptidy byly poté identifikovány pomocí histidinových modifikací s hmotnostními přírůstky +229,0964 a +247,1069 Da v PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Buňky stabilně exprimující fúzovaný gen miniSOG byly umístěny na 6 cm misky.Po dosažení ~80% konfluence byly buňky jednou promyty HBSS (Gibco, #14025092), poté inkubovány s chemickými sondami v HBSS po dobu 1 hodiny při 37 °C a osvětleny modrým světlem.10W LED po dobu 20 minut při pokojové teplotě.K určení, který typ reaktivních kyslíkových sloučenin se účastní PDPL, 0,5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 uM H202, 10 mM NaN3 byly přidány k buňkám jako doplňky.Po promytí studeným PBS byly buňky seškrábány, shromážděny do 1,5 ml centrifugačních zkumavek a sonikovány špičkou po dobu 1 minuty ve 200 μl PBS s 1x inhibitorem proteázy bez EDTA (1 s a 1 s bez, amplituda 35 %).Výsledná směs byla odstřeďována při 15 871 x g po dobu 10 minut při 4 °C a koncentrace supernatantu byla upravena na 1 mg/ml pomocí soupravy pro stanovení proteinu BCA.Přibližně 50 ul výše uvedeného lyzátu bylo inkubováno s 0,1 mM rhodamin azidem (Aladdin, č. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandem a 1 mM CuS04 po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s rotací zdola nahoru.Po click reakci bylo provedeno srážení acetonem přidáním 250 ul předem vychlazeného acetonu ke vzorkům, inkubací při -20 °C po dobu 20 minut a centrifugací při 6010 x g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C.Seberte peletu a vařte v 50 µl 1x Laemmliho pufru po dobu 10 minut při 95 °C.Vzorky byly poté analyzovány na dlouhých gelech SDS-PAGE a vizualizovány pomocí zobrazovacího systému Bio-rad ChemiDoc MP Touch se softwarem Image Lab Touch.
Exprese a purifikace rekombinantního proteinu miniSOG-6xHis byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve.Stručně, buňky E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) byly transformovány pET21a-miniSOG-6xHis a exprese proteinu byla indukována pomocí 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Po buněčné lýze byly proteiny purifikovány pomocí Ni-NTA agarózových kuliček (MCE, č. 70666), dialyzovány proti PBS a skladovány při -80 °C.
Pro in vitro test přiblížení značky na bázi protilátky smíchejte 100 μM purifikovaného miniSOG, 1 mM sondy 3 a 1 μg anti-označené myší monoklonální protilátky (TransGen, #HT501-01) v PBS na celkový reakční objem 50 μl..Reakční směs byla ozařována modrým LED světlem po dobu 0, 2, 5, 10 a 20 minut při teplotě místnosti.Směs byla inkubována s 0,1 mM biotin-PEG3-azidem (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandem a 1 mM CuS04 po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti na třepačce s pohybem vzhůru.Po rychlé reakci přidejte 4x Laemmliho pufr přímo do směsi a vařte při 95°C 10 min.Vzorky byly analyzovány na SDS-PAGE gelech a analyzovány westernovým přenosem se streptavidinem-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Syntetický peptid obsahující histidin s C-koncovou amidací (LHDALDAK-CONH2) byl použit k analýze značení in vitro na bázi blízkého peptidu.V tomto testu bylo 100 uM purifikovaného miniSOG, 10 mM sondy 3 a 2 ug/ml syntetického peptidu smícháno v PBS v celkovém reakčním objemu 50 ul.Reakční směs byla ozařována modrým LED světlem po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti.Jeden mikrolitr vzorku byl analyzován pomocí systému LC-MS (Waters, hmotnostní spektrometr SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight se softwarem pro analýzu spektra MassLynx).
Buňky HEK293T stabilně exprimující miniSOG fúzní gen byly nasazeny na 10 cm misky pro linie s různou lokalizací organel (Mito, ER, Nucleus) a 15 cm misky pro linie Parkin-miniSOG a BRD4-miniSOG.Po dosažení ~90% konfluence byly buňky jednou promyty HBSS, poté inkubovány se sondou 3 v HBSS po dobu 1 hodiny při 37 °C a osvětleny 10W modrou LED při teplotě místnosti.Pro bezkontaktní značení Parkina bylo přidáno 10 uM protonkarbonylkyanidového nosiče m-chlorfenylhydrazon CCCP (Solarbio, #C6700) se sondou 3 v HBSS po dobu 1 hodiny při 37 °C.Kroky buněčné lýzy, click chemie, redukce a alkylace byly stejné, jak je popsáno výše, kromě toho, že byly přidány 2 mg lyzátu a biotin PEG3 azid byl použit v click reakci místo fotodegradovatelného biotin azidu.Po obohacení byly kuličky promyty 3krát 5 ml PBS obsahujícího 0,2 % SDS, 3krát 5 ml PBS obsahujícího 1 M močovinu a 3krát 5 ml PBS.Poté byly 2 ug trypsinu přidány do 300 ul 25 mM ABC obsahujícího 1 M močovinu pro štěpení proteinu přes noc při 37 °C.Reakce byla zastavena přidáním kyseliny mravenčí, dokud nebylo dosaženo pH 2-3.Po trypsinizaci na kuličkách byl roztok peptidu odsolen pomocí kolony SOLAu HRP (Thermo, #60209-001) a vysušen ve vakuovém koncentrátoru Speedvac.Peptidy byly znovu rozpuštěny v 0,1% kyselině mravenčí a 500 ng peptidů bylo analyzováno pomocí hmotnostního spektrometru Orbitrap Fusion Lumos Tribrid vybaveného výše popsaným zdrojem nano-ESI.Peptidy byly separovány na komerčních RP-HPLC předkolonách (75 um x 2 cm) (Thermo, č. 164946) a analytických RP-HPLC kolonách (75 um x 25 cm) (Thermo, č. 164941), obě naplněné 2 um.gradient od 8 % do 35 % ACN za 60 minut, poté lineárně zvýšen na 98 % B za 6 minut při průtoku 300 Nl/min.MS spektra (350-1500 m/z) byla sbírána s rozlišením 60 000, AGC 4 × 105 a maximální vstupní dobou 50 ms.Vybrané ionty byly postupně fragmentovány pomocí HCD ve 3s cyklech s normalizovanou srážkovou energií 30 %, kvadrupólovým izolačním oknem 1,6 m/z a rozlišením 15 000. 5 × 104 tandemový hmotnostní spektrometr AGC cíl a maximální doba nástřiku byly použity 22 ms.Dynamické vyloučení je nastaveno na 45 sekund. Nepřiřazené ionty nebo ionty s nábojem 1+ a >7+ byly pro MS/MS odmítnuty. Nepřiřazené ionty nebo ionty s nábojem 1+ a >7+ byly pro MS/MS odmítnuty. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ a >7+ были отклонены для МС/МС. Nepřiřazené ionty nebo ionty s nábojem 1+ a >7+ byly pro MS/MS odmítnuty.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ a >7+ были отклонены для МС/МС. Nespecifikované ionty nebo ionty s nábojem 1+ a >7+ byly pro MS/MS odmítnuty.
Kroky přípravy vzorku až po obohacení kuliček NeutrAvidin byly stejné jako při analýze LC-MS/MS popsané výše.Přibližně 50 ug lyzátu bylo použito jako vstup pro kontrolu nanášení a 2 mg lyzátu bylo použito pro click reakce.Po obohacení a promytí neutravidinem byly navázané proteiny eluovány přidáním 50 ul Laemmliho pufru ke kuličkám agarózové pryskyřice a varem při 95 °C po dobu 5 minut.Kontrolní vstup a vzorky obohacené o kuličky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a přeneseny na PVDF membrány (Millipore, #ISEQ00010) standardními metodami Western blot.Membrány byly blokovány 5% odstředěným mlékem (Sangon, #A600669) v TBS obsahujícím 0,1% tween-20 (TBST) a inkubovány postupně s primárními a sekundárními protilátkami.Primární protilátky byly zředěny 1:1000 v 5% odstředěném mléce v TBST a inkubovány přes noc při 4 °C.Sekundární protilátky byly použity v poměru 1:5000 a inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti.Membrány byly vizualizovány chemiluminiscencí za použití zobrazovacího systému Chemidoc MP.Všechny nerozřezané skeny blotů a gelů na obrázku jsou prezentovány jako nezpracovaná data.
Primární protilátky použité v této studii zahrnovaly králičí anti-SFPQ monoklonální protilátku (CST, č. 71992), králičí anti-FUS monoklonální protilátku (CST, č. 67840), králičí anti-NSUN2 polyklonální protilátku (Proteintech, č. 20854-1- AP), králičí polyklonální protilátka anti-mSin3A (Abcam, #ab3479), myší monoklonální protilátka proti značce (TransGen, #HT201-02), myší monoklonální protilátka proti β-aktinu (TransGen, #HC201-01), králičí anti -CDK2 monoklonální protilátka (ABclonal, #A0094), králičí monoklonální protilátka proti CTBP1 (ABclonal, #A11600), králičí polyklonální protilátka proti DUT (ABclonal, #A2901), králičí polyklonální protilátka proti PSMC4 (ABclonal, #A2505), králičí anti- DNAJB1 polyklonální protilátka (ABclonal, # A5504).Tyto protilátky byly použity v ředění 1:1000 v 5% odstředěném mléce v TBST.Sekundární protilátky použité v této studii zahrnovaly anti-králičí IgG (TransGen, #HS101-01), anti-myší IgG (TransGen, #HS201-01) v ředění 1:5000.
Pro další zkoumání, zda BRD4 interaguje s SFPQ, byly stabilní buňky HEK293T a BRD4-miniSOG nadměrně exprimující HEK293T umístěny na 10 cm misky.Buňky byly promyty studeným PBS a lyžovány v 1 ml Pierce IP lyzačního pufru (Thermo Fisher, #87787) s inhibitorem proteázy bez EDTA po dobu 30 minut při 4 °C.Poté byly lyzáty shromážděny v 1,5 ml centrifugačních zkumavkách a centrifugovány při 15 871 xg po dobu 10 minut při 4 °C.Supernatant byl sklizen a inkubován s 5 ug anti-V5 značené myší monoklonální protilátky (CST, #80076) přes noc při 4 °C.Promyjte přibližně 50 ul magnetických kuliček proteinu A/G (MCE, #HY-K0202) dvakrát PBS obsahujícím 0,5 % Tween-20.Poté byly buněčné lyzáty inkubovány s magnetickými kuličkami po dobu 4 hodin při 4 °C s rotací zdola nahoru.Poté byly kuličky čtyřikrát promyty 1 ml PBST pufru a vařeny při 95 °C po dobu 5 minut.Vzorky byly analyzovány na SDS-PAGE gelech a přeneseny na PVDF membrány za použití standardních metod Western blot.Membrány byly blokovány 5% odstředěným mlékem v TBST a inkubovány postupně s primárními a sekundárními protilátkami.Primární protilátka Králičí anti-SFPQ monoklonální protilátka (CST, #71992) byla použita v poměru 1:1000 v 5% odstředěném mléce v TBST a inkubována přes noc při 4 °C.Anti-králičí IgG byl použit v poměru 1:5000 a inkubován po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti.Membrány byly vizualizovány chemiluminiscencí za použití zobrazovacího systému Chemidoc MP.
Všechny struktury použité pro analýzu plochy přístupného rozpouštědlu (SASA) byly získány z Protein Data Bank (PDB)52 nebo AlphaFold Protein Structure Database53.Absolutní SASA byla vypočtena pro každý zbytek pomocí programu FreeSASA.K získání střední hodnoty SASA pro každou strukturu byla použita pouze úplná a jednoznačná data SASA pro značený histidin a jeho sousedy.Relativní dostupnost rozpouštědla (RSA) pro každý histidin byla vypočtena dělením absolutní hodnoty SASA empirickou maximální možnou plochou povrchu zbytku dostupnou pro rozpouštědlo.Všechny histidiny byly poté klasifikovány jako skryté, pokud byl průměrný RSA nižší než 20 %, jinak byly exponovány56.
Nezpracované soubory získané v režimu DDA byly prohledávány pomocí Proteome Discoverer (v2.5) nebo MSfragger (Fragpipe v15.0) v příslušné ověřené proteinové databázi SwissProt obsahující běžné kontaminanty.Peptidy vyžadovaly kompletní trypsin se dvěma chybějícími štěpnými místy, karbamoylovou methylaci jako fixní modifikaci a oxidaci methioninu jako dynamickou modifikaci.Tolerance hmotnosti prekurzoru a fragmentu byly nastaveny na 10 ppm a 0,02 Da (MS2 Orbitrap), v daném pořadí. Kontaminanty byly odstraněny a proteiny byly filtrovány, aby se dosáhlo falešné míry objevení <1 %. Kontaminanty byly odstraněny a proteiny byly filtrovány, aby se dosáhlo falešné míry objevení <1 %. Попадания загрязняющих веществ ыли удалены, а а б белки отфилже purna к <we%. Kontaminanty byly odstraněny a proteiny filtrovány, aby se dosáhlo falešné detekce <1 %.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1 % 的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованх длованх жонстрованя длованх жонстрованя дляжне%. Kontaminanty byly odstraněny a proteiny filtrovány, aby se dosáhlo falešně pozitivních výsledků < 1 %.Pro kvantitativní analýzu bez použití značek byl použit normalizovaný obsah proteinu ze tří biologických opakování.Analýza subcelulární lokalizace proteinu byla provedena pomocí analýzy genové ontologie (GO) z DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 a databází sestavených a publikovaných skupinou Alice Ting.Mapa sopky byla získána z Persea (v1.6.15.0). Násobkové změny v množství proteinu byly testovány na statistickou významnost pomocí oboustranného t-testu a proteinové zásahy byly identifikovány se změnou hojnosti >2 (pokud není uvedeno jinak) a hodnotou p <0,05. Násobkové změny v množství proteinu byly testovány na statistickou významnost pomocí oboustranného t-testu a proteinové zásahy byly identifikovány se změnou hojnosti >2 (pokud není uvedeno jinak) a hodnotou p <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Násobkové změny obsahu proteinu byly testovány na statistickou významnost pomocí dvoustranného t-testu a shody proteinů byly identifikovány se změnou obsahu >2 (pokud není uvedeno jinak) a hodnotou p <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 的 的 显着性 ， 并 确定 蛋白质 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 P 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 的 丰度 变化> 2 （另 说明） 和 P 值 <0,05。 <0,05。 <0,05。 <0,05。 <0,05。 <0,05。 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Statistická významnost násobných změn v obsahu proteinu byla testována pomocí dvoustranného t-testu a proteinové shody byly stanoveny pro změny obsahu >2 (pokud není uvedeno jinak) a p-hodnoty <0,05.Analýza interakce proteinů byla provedena pomocí analýzy GO spolu s databází String.
Byly provedeny tři biologické replikáty s podobnými výsledky.Statistická analýza byla provedena pomocí GraphPad Prism (software GraphPad) a grafy sopek byly vytvořeny pomocí Perseus (v1.6.15.0).Pro srovnání těchto dvou skupin byly hodnoty p stanoveny pomocí dvoustranného Studentova t-testu.Do sopečných grafů byly zahrnuty pouze singletonové proteiny identifikované alespoň dvakrát v experimentální skupině a odpovídající chybějící hodnoty v kontrolní skupině byly nahrazeny Perseem z normální distribuce, aby bylo možné vypočítat p-hodnotu.Chybové úsečky představují průměr ± standardní odchylku.V proteomických analýzách pro statistickou analýzu bylo zachováno množství proteinů, které se objevily v alespoň dvou biologických replikátech.K předběžnému stanovení velikosti vzorku nebyly použity statistické metody.Experimenty nejsou náhodné.Vědci nebyli k úkolům při experimentu a vyhodnocování výsledků slepí.
Další informace o designu studie najdete v abstraktu Nature Research Report propojeném s tímto článkem.
Data hmotnostní spektrometrie získaná v této studii byla předložena konsorciu ProteomeXchange Consortium prostřednictvím partnerského úložiště iProX57 pod datovým souborem ID PXD034811 (datový soubor PDPL-MS).Nezpracovaná data jsou poskytována ve formě souborů nezpracovaných dat.Tento článek poskytuje původní data.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Poznávání sousedství: využití biotinylace závislé na blízkosti k charakterizaci proteinových komplexů a mapování organel. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Poznávání sousedství: využití biotinylace závislé na blízkosti k charakterizaci proteinových komplexů a mapování organel.Gingras, AS, Abe, KT a Raut, B. Obeznámenost s okolím: využití biotinylace závislé na blízkosti k charakterizaci proteinových komplexů a mapování organel. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质囋白质复傞物复吞物复吞物复吞物复吞物复吞物复吞物 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Pochopení sousedství: využijte závislosti sousedství na biologickém životě.Gingras, AS, Abe, KT a Raut, B. Pochopení blízkosti: charakterizace proteinových komplexů a mapování organel pomocí biotinylace závislé na blízkosti.Proud.Můj názor.Chemikálie.biologie 48, 44–54 (2019).
Geri, JB a kol.Mapování mikroprostředí přenosem Dexterovy energie do imunitních buněk.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL a kol.Sítě se dvěma proteomy detekují buněčně specifickou remodelaci lidského interaktomu.Buňky 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Čas odeslání: 15. září 2022
