Zprávy

Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Účinné fotosenzibilizátory jsou zvláště důležité pro široké klinické použití fototerapie.Konvenční fotosenzitizéry však obecně trpí krátkou absorpcí vlnových délek, nedostatečnou fotostabilitou, nízkým kvantovým výtěžkem reaktivních forem kyslíku (ROS) a agregací vyvolaným zhášením ROS.Zde popisujeme blízký infračervený (NIR) supramolekulární fotosenzitizér (RuDA) zprostředkovaný samouspořádáním organokovových komplexů Ru(II)-arenu ve vodném roztoku.RuDA může generovat singletový kyslík (1O2) pouze v agregovaném stavu a vykazuje zjevné chování při vytváření 1O2 vyvolané agregací v důsledku významného nárůstu procesu křížení mezi singlet-tripletovým systémem.Při působení laserového světla o vlnové délce 808 nm RuDA vykazuje kvantový výtěžek 1O2 16,4 % (indocyaninová zeleň schválená FDA: ΦΔ=0,2 %) a vysokou účinnost fototermální konverze 24,2 % (komerční zlaté nanorody) s vynikající fotostabilitou.: 21,0 %, zlaté nanočástice: 13,0 %).Kromě toho se RuDA-NP s dobrou biokompatibilitou mohou přednostně akumulovat v místech nádoru, což způsobuje významnou regresi nádoru během fotodynamické terapie s 95,2% snížením objemu nádoru in vivo.Tato fotodynamická terapie zesilující agregaci poskytuje strategii pro vývoj fotosenzibilizátorů s příznivými fotofyzikálními a fotochemickými vlastnostmi.
Fotodynamická terapie (PDT) je ve srovnání s konvenční terapií atraktivní léčbou rakoviny díky svým významným výhodám, jako je přesná časoprostorová kontrola, neinvazivita, zanedbatelná léková rezistence a minimalizace nežádoucích účinků 1,2,3.Při světelném ozáření mohou být použité fotosenzibilizátory aktivovány za vzniku vysoce reaktivních forem kyslíku (ROS), což vede k apoptóze/nekróze nebo imunitním reakcím4,5. Většina konvenčních fotosenzibilizátorů, jako jsou chloriny, porfyriny a antrachinony, však mají relativně krátkovlnnou absorpci (frekvence < 680 nm), což má za následek špatnou penetraci světla kvůli intenzivní absorpci biologických molekul (např. hemoglobinu a melaninu). viditelná oblast6,7. Většina konvenčních fotosenzibilizátorů, jako jsou chloriny, porfyriny a antrachinony, však mají relativně krátkovlnnou absorpci (frekvence < 680 nm), což má za následek špatnou penetraci světla kvůli intenzivní absorpci biologických molekul (např. hemoglobinu a melaninu). viditelná oblast6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. Nicméně nejběžnější fotosenzibilizátory, jako jsou chloriny, porfyriny a antrachinony, mají relativně krátkou vlnovou délku absorpce (< 680 nm), což vede ke špatnému pronikání světla v důsledku intenzivní absorpce biologických molekul (např. hemoglobinu a melaninu) do viditelné oblasti6,7.然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 如 二 氢 卟酚 、 和 蒽醌 ， 相对 短 短 波长 吸收 频率 <680 nm） ， 因此 由于 对 生物 分子 （如 血红 黑色素 ， ， ， ， 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素 黑色素导致光穿透性差。然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 具有 相对 短 的 波长 （频率 频率 <680 nm） 因此 由于 对 分子 （血红 和 黑色素 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. Nicméně většina tradičních fotosenzibilizátorů, jako jsou chloriny, porfyriny a antrachinony, mají relativně krátkou vlnovou délku absorpce (frekvence < 680 nm) kvůli silné absorpci biomolekul, jako je hemoglobin a melanin, což má za následek špatnou penetraci světla.Viditelná oblast 6.7.Pro fototerapii se proto dobře hodí fotosenzibilizátory absorbující blízké infračervené záření (NIR), které se aktivují v „terapeutickém okně“ 700–900 nm.Protože blízké infračervené světlo je nejméně absorbováno biologickými tkáněmi, může vést k hlubšímu pronikání a menšímu poškození světlem8,9.
Stávající fotosenzibilizátory absorbující NIR mají bohužel obecně špatnou fotostabilitu, nízkou kapacitu tvorby singletového kyslíku (1O2) a zhášení 1O2 vyvolané agregací, což omezuje jejich klinické použití10,11.Ačkoli bylo vynaloženo velké úsilí na zlepšení fotofyzikálních a fotochemických vlastností konvenčních fotosenzitizérů, několik zpráv dosud uvádělo, že fotosenzitizéry absorbující NIR mohou vyřešit všechny tyto problémy.Kromě toho se několik fotosenzitizérů ukázalo jako slibné pro účinnou generaci 10212,13,14 při ozařování světlem nad 800 nm, protože energie fotonu rychle klesá v blízké IR oblasti.Trifenylamin (TFA) jako donor elektronů a [1,2,5]thiadiazol-[3,4-i]dipyrido[a,c]fenazin (TDP) jako skupina akceptorů elektronů Barviva typu donor-akceptor (DA) třída barviv absorbujících blízké infračervené záření, které byly rozsáhle studovány pro blízké infračervené biozobrazování II a fototermální terapii (PTT) kvůli jejich úzkému pásmu.Barviva typu DA lze tedy použít pro PDT s blízkou IR excitací, i když jen zřídka byla studována jako fotosenzibilizátory pro PDT.
Je dobře známo, že vysoká účinnost mezisystémového křížení (ISC) fotosenzibilizátorů podporuje tvorbu 1O2.Běžnou strategií pro pokrok v procesu ISC je posílení spin-orbitálního spojení (SOC) fotosenzibilizátorů zavedením těžkých atomů nebo speciálních organických skupin.Tento přístup má však stále některé nevýhody a omezení19,20.V poslední době poskytuje supramolekulární samouspořádání inteligentní přístup zdola nahoru pro výrobu funkčních materiálů na molekulární úrovni21,22 s četnými výhodami ve fototerapii: (1) samosestavující fotosenzitizéry mohou mít potenciál vytvářet páskové struktury.Podobně jako u elektronických struktur s hustším rozložením energetických hladin v důsledku překrývajících se drah mezi stavebními bloky.Proto se zlepší energetická shoda mezi spodním singletovým excitovaným stavem (SI) a sousedním tripletovým excitovaným stavem (Tn), což je výhodné pro ISC proces 23, 24.(2) Supramolekulární sestava sníží neradiační relaxaci na základě mechanismu omezení intramolekulárního pohybu (RIM), který také podporuje proces ISC25,26.(3) Supramolekulární sestava může chránit vnitřní molekuly monomeru před oxidací a degradací, čímž výrazně zlepšuje fotostabilitu fotosenzibilizátoru.Vzhledem k výše uvedeným výhodám se domníváme, že systémy supramolekulárních fotosenzitizérů mohou být slibnou alternativou k překonání nedostatků PDT.
Komplexy na bázi Ru(II) jsou slibnou lékařskou platformou pro potenciální aplikace v diagnostice a terapii nemocí díky svým jedinečným a atraktivním biologickým vlastnostem28,29,30,31,32,33,34.Kromě toho množství excitovaných stavů a ​​laditelné fotofyzikálně-chemické vlastnosti komplexů na bázi Ru(II) poskytují velké výhody pro vývoj fotosenzibilizátorů na bázi Ru(II)35,36,37,38,39,40.Pozoruhodným příkladem je ruthenium(II) polypyridylový komplex TLD-1433, který je v současné době ve fázi II klinických studií jako fotosenzibilizátor pro léčbu nesvalového invazivního karcinomu močového měchýře (NMIBC)41.Kromě toho jsou organokovové komplexy ruthenium(II)arenu široce používány jako chemoterapeutická činidla pro léčbu rakoviny kvůli jejich nízké toxicitě a snadné modifikaci42,43,44,45.Iontové vlastnosti organokovových komplexů Ru(II)-arenu mohou nejen zlepšit špatnou rozpustnost DA chromoforů v běžných rozpouštědlech, ale také zlepšit sestavování DA chromoforů.Kromě toho může pseudooktaedrická polosendvičová struktura organokovových komplexů Ru(II)-arenů stericky bránit H-agregaci chromoforů typu DA, a tím usnadňovat tvorbu J-agregace s červeně posunutými absorpčními pásy.Avšak inherentní nevýhody komplexů Ru(II)-aren, jako je nízká stabilita a/nebo špatná biologická dostupnost, mohou ovlivnit terapeutickou účinnost a in vivo aktivitu komplexů aren-Ru(II).Studie však ukázaly, že tyto nevýhody lze překonat zapouzdřením komplexů ruthenia s biokompatibilními polymery fyzikálním zapouzdřením nebo kovalentní konjugací.
V této práci popisujeme DA-konjugované komplexy Ru(II)-arenu (RuDA) se spouštěčem NIR prostřednictvím koordinační vazby mezi chromoforem DAD a skupinou Ru(II)-arenu.Výsledné komplexy se mohou samovolně skládat do metalosupramolekulárních vezikul ve vodě díky nekovalentním interakcím.Je pozoruhodné, že supramolekulární sestava vybavila RuDA polymerací indukovanými mezisystémovými cross-over vlastnostmi, což významně zvýšilo účinnost ISC, což bylo velmi příznivé pro PDT (obr. 1A).Ke zvýšení akumulace nádoru a in vivo biokompatibility byl použit FDA schválený Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) k zapouzdření RuDA47,48,49 k vytvoření nanočástic RuDA-NP (obrázek 1B), které působily jako vysoce účinná PDT/dvojitá režim PTT proxy .Ve fototerapii rakoviny (obrázek 1C) byl RuDA-NP použit k léčbě nahých myší s nádory MDA-MB-231 ke studiu účinnosti PDT a PTT in vivo.
Schematické znázornění fotofyzikálního mechanismu RuDA v monomerních a agregovaných formách pro fototerapii rakoviny, syntéza B RuDA-NP a C RuDA-NP pro NIR-aktivované PDT a PTT.
RuDA, skládající se z funkčnosti TPA a TDP, byla připravena podle postupu uvedeného na doplňkovém obrázku 1 (obrázek 2A) a RuDA byla charakterizována 1H a 13C NMR spektry, hmotnostní spektrometrií s ionizací elektrosprejem a elementární analýzou (doplňkové obrázky 2-4 ).Mapa rozdílu elektronové hustoty RuDA nejnižšího singletového přechodu byla vypočtena pomocí časově závislé funkční teorie hustoty (TD-DFT) pro studium procesu přenosu náboje.Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 5, elektronová hustota se po fotoexcitaci pohybuje hlavně z trifenylaminu na akceptorovou jednotku TDP, což lze připsat typickému přechodu přenosu intramolekulárního náboje (CT).
Chemická struktura rudy B Absorpční spektra rudy ve směsích různých poměrů DMF a vody.C Normalizované hodnoty absorpce RuDA (800 nm) a ICG (779 nm) v závislosti na čase při 0,5 W cm-2 laserového světla 808 nm.D Fotodegradaci ABDA indikuje RuDA-indukovaná tvorba 1O2 ve směsích DMF/H2O s různým obsahem vody působením laserového záření o vlnové délce 808 nm a výkonu 0,5 W/cm2.
Abstrakt—UV-viditelná absorpční spektroskopie byla použita ke studiu samouspořádacích vlastností rudy ve směsích DMF a vody v různých poměrech.Jak je znázorněno na Obr.2B, RuDA vykazuje absorpční pásy od 600 do 900 nm v DMF s maximálním absorpčním pásem při 729 nm.Zvyšování množství vody vedlo k postupnému červenému posunu maxima absorpce rudy na 800 nm, což ukazuje na J-agregaci rudy v sestaveném systému.Fotoluminiscenční spektra RuDA v různých rozpouštědlech jsou znázorněna na doplňkovém obrázku 6. Zdá se, že RuDA vykazuje typickou luminiscenci NIR-II s maximální emisní vlnovou délkou cca.1050 nm v CH2CI2 a CH30H.Velký Stokesův posun (asi 300 nm) RuDA ukazuje na významnou změnu geometrie excitovaného stavu a vznik nízkoenergetických excitovaných stavů.Kvantové výtěžky luminiscence rudy v CH2CI2 a CH3OH byly stanoveny na 3,3 a 0,6 %.Ve směsi metanolu a vody (5/95, obj./obj.) byl však pozorován mírný červený posun emise a pokles kvantového výtěžku (0,22 %), což může být způsobeno samoskládáním rudy .
Pro vizualizaci samoskládání ORE jsme použili mikroskopii kapalné atomové síly (AFM) k vizualizaci morfologických změn v ORE v roztoku methanolu po přidání vody.Když byl obsah vody pod 80 %, nebyla pozorována žádná jasná agregace (doplňkový obr. 7).S dalším zvýšením obsahu vody na 90–95 % se však objevily drobné nanočástice, které naznačovaly samouspořádání Rudy, navíc laserové ozařování o vlnové délce 808 nm neovlivnilo intenzitu absorpce RuDA ve vod. roztok (obr. 2C a doplňkový obr. 8).Naproti tomu absorbance indocyaninové zeleně (ICG jako kontrola) rychle klesla při 779 nm, což ukazuje na vynikající fotostabilitu RuDA.Kromě toho byla stabilita RuDA-NP v PBS (pH = 5,4, 7,4 a 9,0), 10% FBS a DMEM (vysoká hladina glukózy) zkoumána pomocí UV-viditelné absorpční spektroskopie v různých časových bodech.Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 9, mírné změny v absorpčních pásech RuDA-NP byly pozorovány v PBS při pH 7,4/9,0, FBS a DMEM, což ukazuje na vynikající stabilitu RuDA-NP.V kyselém prostředí (рН = 5,4) však byla nalezena hydrolýza rudy.Dále jsme také hodnotili stabilitu RuDA a RuDA-NP pomocí metod vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC).Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 10, RuDA byl stabilní ve směsi methanolu a vody (50/50, obj./obj.) první hodinu a hydrolýza byla pozorována po 4 hodinách.U RuDA NP byl však pozorován pouze široký konkávně-konvexní pík.Proto byla k hodnocení stability RuDA NP v PBS (pH = 7,4) použita gelová permeační chromatografie (GPC).Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 11, po 8 hodinách inkubace za testovaných podmínek se výška píku, šířka píku a plocha píku NP RuDA významně nezměnily, což ukazuje na vynikající stabilitu NP RuDA.Kromě toho snímky TEM ukázaly, že morfologie nanočástic RuDA-NP zůstala prakticky nezměněna po 24 hodinách ve zředěném pufru PBS (pH = 7,4, doplňkový obrázek 12).
Protože samoskládání může rudě propůjčit různé funkční a chemické vlastnosti, pozorovali jsme uvolňování 9,10-anthracendiylbis(methylen)dimalonové kyseliny (ABDA, indikátor 1O2) ve směsích methanol-voda.Ruda s různým obsahem vody50.Jak je znázorněno na obrázku 2D a doplňkovém obrázku 13, nebyla pozorována žádná degradace ABDA, když byl obsah vody nižší než 20 %.Se zvýšením vlhkosti na 40 % došlo k degradaci ABDA, o čemž svědčí pokles intenzity fluorescence ABDA.Bylo také pozorováno, že vyšší obsah vody vede k rychlejší degradaci, což naznačuje, že samoskládání RuDA je nezbytné a prospěšné pro degradaci ABDA.Tento jev se velmi liší od moderních chromoforů ACQ (agregace-indukované zhášení).Při ozáření laserem o vlnové délce 808 nm je kvantový výtěžek 1O2 RuDA ve směsi 98 % H2O/2 % DMF 16,4 %, což je 82krát více než u ICG (ΦΔ = 0,2 %)51, prokazující pozoruhodnou efektivitu výroby 1O2 RuDA ve stavu agregace.
Elektronové spiny s použitím 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinonu (TEMP) a 5,5-dimethyl-1-pyrrolin-N-oxidu (DMPO) jako spinových pastí K identifikaci výsledných druhů byla použita rezonanční spektroskopie (ESR). AFK.od RuDA.Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 14, bylo potvrzeno, že 102 je generován v časech ozařování mezi 0 a 4 minutami.Navíc, když byl RuDA inkubován s DMPO za ozařování, byl detekován typický čtyřřádkový EPR signál aduktu 1:2:2:1 DMPO-OH·, což ukazuje na tvorbu hydroxylových radikálů (OH·).Celkově výše uvedené výsledky demonstrují schopnost RuDA stimulovat produkci ROS prostřednictvím duálního procesu fotosenzibilizace typu I/II.
Pro lepší pochopení elektronických vlastností RuDA v monomerních a agregovaných formách byly pomocí metody DFT vypočteny hraniční molekulární orbitaly RuDA v monomerních a dimerních formách.Jak je znázorněno na Obr.3A, nejvyšší obsazený molekulární orbital (HOMO) monomerního RuDA je delokalizován podél hlavního řetězce ligandu a nejnižší neobsazený molekulární orbital (LUMO) je vycentrován na TDP akceptorové jednotce.Naopak elektronová hustota v dimerním HOMO je soustředěna na ligand jedné molekuly RuDA, zatímco elektronová hustota v LUMO je soustředěna hlavně na akceptorovou jednotku jiné molekuly RuDA, což ukazuje, že RuDA je v dimeru.Vlastnosti CT.
A HOMO a LUMO rudy jsou vypočteny v monomerních a dimerních formách.B Singletové a tripletové energetické hladiny rudy v monomerech a dimerech.C Odhadované hladiny RuDA a možných ISC kanálů jako monomerní C a dimerní D. Šipky označují možné ISC kanály.
Distribuce elektronů a děr v nízkoenergetických singletových excitovaných stavech RuDA v monomerní a dimerní formě byla analyzována pomocí softwaru Multiwfn 3.852.53, které byly vypočteny pomocí metody TD-DFT.Jak je uvedeno na doplňkovém štítku.Jak je znázorněno na obrázcích 1-2, monomerní otvory RDA jsou většinou delokalizovány podél kostry ligandu v těchto singletových excitovaných stavech, zatímco elektrony jsou většinou umístěny ve skupině TDP, což demonstruje intramolekulární charakteristiky CT.Navíc u těchto singletových excitovaných stavů dochází k většímu či menšímu překrývání mezi dírami a elektrony, což naznačuje, že tyto singletové excitované stavy do určité míry přispívají místní excitací (LE).U dimerů byl kromě intramolekulárních znaků CT a LE v příslušných stavech pozorován určitý podíl intermolekulárních znaků CT, zejména S3, S4, S7 a S8, na základě intermolekulární CT analýzy, přičemž mezimolekulárními přechody CT byly hlavní. (Doplňková tabulka).3).
Abychom lépe porozuměli experimentálním výsledkům, dále jsme zkoumali vlastnosti excitovaných stavů RuDA, abychom prozkoumali rozdíly mezi monomery a dimery (doplňkové tabulky 4–5).Jak je znázorněno na obrázku 3B, energetické hladiny singletových a tripletových excitovaných stavů dimeru jsou mnohem hustší než hladiny monomeru, což pomáhá snížit energetickou mezeru mezi S1 a Tn. Bylo hlášeno, že ISC přechody by mohly být realizovány v rámci malé energetické mezery (ΔES1-Tn < 0,3 eV) mezi S1 a Tn54. Bylo hlášeno, že ISC přechody by mohly být realizovány v rámci malé energetické mezery (ΔES1-Tn < 0,3 eV) mezi S1 a Tn54. Сообщалось, что переходы isc могут ыыть реализованы в пределах ннеболж4 э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э э энер щ э э э э ot энеб δэ. Bylo hlášeno, že ISC přechody lze realizovat v rámci malé energetické mezery (ΔES1-Tn <0,3 eV) mezi S1 a Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход isc может ыыть реализован в пределах неболш 14 ээ и и и δ δes1-щ δes1-щ δes1-щ δes1-щ δes1-щ δes1-щ δes1-щ δes1-щ Bylo hlášeno, že ISC přechod může být realizován v rámci malé energetické mezery (ΔES1-Tn < 0,3 eV) mezi S1 a Tn54.Kromě toho se pouze jeden orbital, obsazený nebo neobsazený, musí lišit ve vázaných singletových a tripletových stavech, aby poskytl nenulový integrál SOC.Na základě analýzy excitační energie a orbitálního přechodu jsou tedy všechny možné kanály přechodu ISC znázorněny na Obr.3C,D.Je pozoruhodné, že v monomeru je k dispozici pouze jeden ISC kanál, zatímco dimerní forma má čtyři ISC kanály, které mohou zlepšit ISC přechod.Proto je rozumné předpokládat, že čím více molekul RuDA je agregováno, tím dostupnější budou ISC kanály.Agregáty RuDA proto mohou tvořit dvoupásmové elektronické struktury v singletových a tripletových stavech, čímž se snižuje energetická mezera mezi S1 a dostupným Tn, čímž se zvyšuje účinnost ISC pro usnadnění generace 1O2.
Abychom dále objasnili základní mechanismus, syntetizovali jsme referenční sloučeninu komplexu aren-Ru(II) (RuET) nahrazením dvou ethylových skupin dvěma trifenylaminový fenylovými skupinami v RuDA (obr. 4A, pro úplnou charakterizaci viz ESI, doplněk 15 -21 ) Od donoru (diethylaminu) po akceptor (TDF) má RuET stejné intramolekulární CT charakteristiky jako RuDA.Jak se očekávalo, absorpční spektrum RuET v DMF vykazovalo pásmo přenosu náboje s nízkou energií se silnou absorpcí v blízké infračervené oblasti v oblasti 600–1100 nm (obr. 4B).Navíc byla také pozorována agregace RuET se zvyšujícím se obsahem vody, což se projevilo v červeném posunu absorpčního maxima, což bylo dále potvrzeno zobrazením tekutým AFM (doplňkový obr. 22).Výsledky ukazují, že RuET, stejně jako RuDA, může vytvářet intramolekulární stavy a samo se skládat do agregovaných struktur.
Chemická struktura RuET.B Absorpční spektra RuET ve směsích různých poměrů DMF a vody.Pozemky C EIS Nyquist pro RuDA a RuET.Fotoproudové odezvy D RuDA a RuET při působení laserového záření o vlnové délce 808 nm.
Fotodegradace ABDA v přítomnosti RuET byla hodnocena ozářením laserem o vlnové délce 808 nm.Překvapivě nebyla pozorována žádná degradace ABDA v různých vodních frakcích (doplňkový obr. 23).Možným důvodem je, že RuET nemůže účinně tvořit páskovou elektronickou strukturu, protože ethylový řetězec nepodporuje účinný přenos mezimolekulárního náboje.Pro porovnání fotoelektrochemických vlastností RuDA a RuET byla proto provedena elektrochemická impedanční spektroskopie (EIS) a měření přechodného fotoproudu.Podle Nyquistova grafu (obrázek 4C) vykazuje RuDA mnohem menší poloměr než RuET, což znamená, že RuDA56 má rychlejší mezimolekulární transport elektronů a lepší vodivost.Kromě toho je hustota fotoproudu RuDA mnohem vyšší než hustota RuET (obr. 4D), což potvrzuje lepší účinnost přenosu náboje RuDA57.Fenylová skupina trifenylaminu v Rudě tedy hraje důležitou roli při zajišťování přenosu mezimolekulárního náboje a vytváření pásové elektronové struktury.
Pro zvýšení akumulace nádoru a in vivo biokompatibility jsme dále zapouzdřili RuDA pomocí F127.Průměrný hydrodynamický průměr RuDA-NP byl stanoven na 123,1 nm s úzkou distribucí (PDI = 0,089) pomocí metody dynamického rozptylu světla (DLS) (obrázek 5A), která podporovala akumulaci nádoru zvýšením permeability a retence.EPR) efekt.Snímky TEM ukázaly, že Ore NP mají jednotný sférický tvar s průměrným průměrem 86 nm.Je pozoruhodné, že absorpční maximum RuDA-NP se objevilo při 800 nm (doplňkový obrázek 24), což naznačuje, že RuDA-NP si mohou zachovat funkce a vlastnosti samosestavujících RuDA.Vypočtený kvantový výtěžek ROS pro NP Ore je 15,9 %, což je srovnatelné s Ore Fototermální vlastnosti RuDA NP byly studovány za působení laserového záření o vlnové délce 808 nm pomocí infračervené kamery.Jak je znázorněno na Obr.5B,C, kontrolní skupina (pouze PBS) zaznamenala mírné zvýšení teploty, zatímco teplota roztoku RuDA-NPs se rychle zvýšila se zvyšující se teplotou (AT) na 15,5, 26,1 a 43,0 °C.Vysoké koncentrace byly 25, 50 a 100 uM, v daném pořadí, což ukazuje na silný fototermální účinek RuDA NP.Kromě toho byla provedena měření cyklu ohřevu/chlazení za účelem vyhodnocení fototermální stability RuDA-NP a srovnání s ICG.Teplota rudných NP se po pěti cyklech ohřevu/chlazení nesnížila (obr. 5D), což ukazuje na vynikající fototermální stabilitu rudných NP.Naproti tomu ICG vykazuje nižší fototermální stabilitu, jak je patrné ze zjevného vymizení fototermální teplotní plošiny za stejných podmínek.Podle předchozí metody58 byla účinnost fototermální konverze (PCE) RuDA-NP vypočtena jako 24,2 %, což je vyšší hodnota než u stávajících fototermálních materiálů, jako jsou zlaté nanoryty (21,0 %) a zlaté nanoslupky (13,0 %)59.NP Ore tedy vykazují vynikající fototermální vlastnosti, což z nich dělá slibné PTT látky.
Analýza DLS a TEM snímků RuDA NP (vložka).B Tepelné snímky různých koncentrací RuDA NP vystavených laserovému záření o vlnové délce 808 nm (0,5 W cm-2).C Fototermální konverzní křivky různých koncentrací rudných NP, které jsou kvantitativními údaji.B. D Zvýšení teploty ORE NP a ICG během 5 cyklů ohřev-chlazení.
Fotocytotoxicita RuDA NP proti MDA-MB-231 lidským buňkám rakoviny prsu byla hodnocena in vitro.Jak je znázorněno na Obr.6A, B, RuDA-NP a RuDA vykazovaly zanedbatelnou cytotoxicitu v nepřítomnosti ozáření, což znamená nižší toxicitu RuDA-NP a RuDA ve tmě.Po vystavení laserovému záření o vlnové délce 808 nm však RuDA a RuDA NP vykazovaly silnou fotocytotoxicitu proti rakovinným buňkám MDA-MB-231 s hodnotami IC50 (poloviční maximální inhibiční koncentrace) 5,4 a 9,4 μM, v tomto pořadí, což dokazuje že RuDA-NP a RuDA mají potenciál pro fototerapii rakoviny.Kromě toho byla fotocytotoxicita RuDA-NP a RuDA dále zkoumána v přítomnosti vitaminu C (Vc), lapače ROS, aby se objasnila úloha ROS v cytotoxicitě indukované světlem.Je zřejmé, že životaschopnost buněk se po přidání Vc zvýšila a hodnoty IC50 RuDA a RuDA NP byly 25, 7 a 40, 0 μM, v daném pořadí, což dokazuje důležitou roli ROS ve fotocytotoxicitě RuDA a RuDA NP.Světlem indukovaná cytotoxicita RuDA-NP a RuDA v rakovinných buňkách MDA-MB-231 pomocí barvení živých/mrtvých buněk pomocí kalceinu AM (zelená fluorescence pro živé buňky) a propidium jodidu (PI, červená fluorescence pro mrtvé buňky).potvrzeno buňkami) jako fluorescenční sondy.Jak je znázorněno na obrázku 6C, buňky ošetřené RuDA-NP nebo RuDA zůstaly životaschopné bez ozařování, jak dokazuje intenzivní zelená fluorescence.Naopak při laserovém ozáření byla pozorována pouze červená fluorescence, což potvrzuje účinnou fotocytotoxicitu RuDA nebo RuDA NP.Je pozoruhodné, že po přidání Vc se objevila zelená fluorescence, což ukazuje na porušení fotocytotoxicity RuDA a RuDA NP.Tyto výsledky jsou v souladu s testy fotocytotoxicity in vitro.
Životaschopnost buněk A RuDA- a B RuDA-NP v buňkách MDA-MB-231 závislá na dávce v přítomnosti nebo nepřítomnosti Vc (0,5 mM).Chybové úsečky, průměr ± standardní odchylka (n = 3). Nepárové, oboustranné t testy *p < 0,05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. Nepárové, oboustranné t testy *p < 0,05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 a ***p <0,001. Nepárové dvoustranné t-testy *p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 a ***p <0,001. Nepárové dvoustranné t-testy *p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001.C Analýza barvení živých/mrtvých buněk s použitím kalceinu AM a propidium jodidu jako fluorescenčních sond.Měřítko: 30 µm.Jsou ukázány reprezentativní snímky tří biologických opakování z každé skupiny.D Konfokální fluorescenční snímky produkce ROS v buňkách MDA-MB-231 za různých podmínek ošetření.Zelená fluorescence DCF indikuje přítomnost ROS.Ozařujte laserem o vlnové délce 808 nm výkonem 0,5 W/cm2 po dobu 10 minut (300 J/cm2).Měřítko: 30 µm.Jsou ukázány reprezentativní snímky tří biologických opakování z každé skupiny.E Průtoková cytometrie Analýza ošetření RuDA-NP (50 uM) nebo RuDA (50 uM) s nebo bez laseru 808 nm (0,5 W cm-2) v přítomnosti a nepřítomnosti Vc (0,5 mM) po dobu 10 minut.Jsou ukázány reprezentativní snímky tří biologických opakování z každé skupiny.F Nrf-2, HSP70 a HO-1 buněk MDA-MB-231 ošetřených RuDA-NP (50 uM) s nebo bez laserového ozařování 808 nm (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), buňky exprimují 2).Jsou ukázány reprezentativní snímky dvou biologických repetic z každé skupiny.
Intracelulární produkce ROS v buňkách MDA-MB-231 byla zkoumána pomocí metody barvení 2,7-dichlordihydrofluorescein diacetátem (DCFH-DA).Jak je znázorněno na Obr.6D, buňky ošetřené RuDA-NP nebo RuDA vykazovaly zřetelnou zelenou fluorescenci při ozařování laserem 808 nm, což ukazuje, že RuDA-NP a RuDA mají účinnou schopnost generovat ROS.Naopak za nepřítomnosti světla nebo za přítomnosti Vc byl pozorován pouze slabý fluorescenční signál buněk, který indikoval mírnou tvorbu ROS.Intracelulární hladiny ROS v buňkách RuDA-NP a buňkách MDA-MB-231 ošetřených RuDA byly dále stanoveny průtokovou cytometrií.Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 25, průměrná intenzita fluorescence (MFI) generovaná RuDA-NP a RuDA pod laserovým ozářením 808 nm byla významně zvýšena asi 5,1krát a 4,8krát ve srovnání s kontrolní skupinou, což potvrzuje jejich vynikající tvorbu AFK.kapacita.Nicméně intracelulární hladiny ROS v buňkách RuDA-NP nebo MDA-MB-231 ošetřených RuDA byly srovnatelné pouze s kontrolami bez laserového ozařování nebo v přítomnosti Vc, podobně jako výsledky konfokální fluorescenční analýzy.
Ukázalo se, že mitochondrie jsou hlavním cílem komplexů Ru(II)-aren60.Proto byla zkoumána subcelulární lokalizace RuDA a RuDA-NP.Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 26, RuDA a RuDA-NP vykazují podobné profily buněčné distribuce s nejvyšší akumulací v mitochondriích (62,5 ± 4,3 a 60,4 ± 3,6 ng/mg proteinu).V jaderných frakcích rudy a NP rudy však bylo nalezeno pouze malé množství Ru (3,5 a 2,1 %).Zbývající buněčná frakce obsahovala reziduální ruthenium: 31,7 % (30,6 ± 3,4 ng/mg proteinu) pro RuDA a 42,9 % (47,2 ± 4,5 ng/mg proteinu) pro RuDA-NP.Obecně se ruda a NP ruda akumulují hlavně v mitochondriích.K posouzení mitochondriální dysfunkce jsme použili barvení JC-1 a MitoSOX Red k posouzení potenciálu mitochondriální membrány a kapacity produkce superoxidu.Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 27, intenzivní zelená (JC-1) a červená (MitoSOX Red) fluorescence byla pozorována v buňkách ošetřených jak RuDA, tak RuDA-NP pod laserovým ozařováním 808 nm, což naznačuje, že RuDA i RuDA-NP jsou vysoce fluorescenční Dokáže účinně vyvolat depolarizaci mitochondriální membrány a produkci superoxidu.Kromě toho byl stanoven mechanismus buněčné smrti pomocí analýzy založené na průtokové cytometrii annexin V-FITC/propidium jodid (PI).Jak je znázorněno na obrázku 6E, při ozařování laserem 808 nm RuDA a RuDA-NP indukovaly významně zvýšenou rychlost časné apoptózy (spodní pravý kvadrant) v buňkách MDA-MB-231 ve srovnání s PBS nebo PBS plus laser.zpracované buňky.Když se však přidal Vc, míra apoptózy RuDA a RuDA-NP se významně snížila z 50,9 % a 52,0 % na 15,8 % a 17,8 %, v daném pořadí, což potvrzuje důležitou roli ROS ve fotocytotoxicitě RuDA a RuDA-NP..Kromě toho byly ve všech testovaných skupinách (horní levý kvadrant) pozorovány mírně nekrotické buňky, což naznačuje, že apoptóza může být převládající formou buněčné smrti indukované RuDA a RuDA-NP.
Protože poškození oxidativním stresem je hlavní determinantou apoptózy, byl v MDA-MB-231 ošetřených RuDA-NPs zkoumán jaderný faktor spojený s erytroidním 2, faktorem 2 (Nrf2) 62, klíčovým regulátorem antioxidačního systému.Mechanismus účinku RuDA NP indukovaný ozářením.Současně byla také detekována exprese downstream proteinu hemoxygenázy 1 (HO-1).Jak je znázorněno na obrázku 6F a doplňkovém obrázku 29, fototerapie zprostředkovaná RuDA-NP zvýšila hladiny exprese Nrf2 a HO-1 ve srovnání se skupinou PBS, což naznačuje, že RuDA-NP mohou stimulovat signální dráhy oxidačního stresu.Kromě toho pro studium fototermálního účinku RuDA-NPs63 byla také hodnocena exprese proteinu tepelného šoku Hsp70.Je jasné, že buňky ošetřené RuDA-NP + 808 nm laserovým ozářením vykazovaly zvýšenou expresi Hsp70 ve srovnání s dalšími dvěma skupinami, což odráží buněčnou odpověď na hypertermii.
Pozoruhodné výsledky in vitro nás přiměly zkoumat in vivo účinnost RuDA-NP u nahých myší s nádory MDA-MB-231.Distribuce RuDA NP v tkáních byla studována stanovením obsahu ruthenia v játrech, srdci, slezině, ledvinách, plicích a nádorech.Jak je znázorněno na Obr.7A, maximální obsah rudných NP v normálních orgánech se objevil v době prvního pozorování (4 h), zatímco maximální obsah byl stanoven v nádorových tkáních 8 hodin po injekci, pravděpodobně kvůli rudným NP.EPR efekt LF.Podle výsledků distribuce byla optimální délka léčby NP rudou přijata 8 hodin po podání.Pro ilustraci procesu akumulace RuDA-NP v nádorových místech byly fotoakustické (PA) vlastnosti RuDA-NP monitorovány záznamem PA signálů RuDA-NP v různých časech po injekci.Nejprve byl PA signál RuDA-NP vyhodnocen in vivo záznamem PA snímků místa nádoru po intratumorální injekci RuDA-NP.Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku 30, RuDA-NP vykazovaly silný signál PA a existovala pozitivní korelace mezi koncentrací RuDA-NP a intenzitou signálu PA (doplňkový obrázek 30A).Poté byly in vivo PA snímky nádorových míst zaznamenány po intravenózní injekci RuDA a RuDA-NP v různých časových bodech po injekci.Jak je znázorněno na obrázku 7B, signál PA RuDA-NP z místa nádoru se s časem postupně zvyšoval a dosáhl plató 8 hodin po injekci, což je v souladu s výsledky distribuce v tkáních stanovenými analýzou ICP-MS.S ohledem na RuDA (doplňkový obrázek 30B) se maximální intenzita signálu PA objevila 4 hodiny po injekci, což ukazuje na rychlou rychlost vstupu RuDA do nádoru.Kromě toho bylo zkoumáno vylučovací chování RuDA a RuDA-NP stanovením množství ruthenia v moči a stolici pomocí ICP-MS.Hlavní cestou eliminace RuDA (doplňkový obrázek 31) a RuDA-NP (obr. 7C) je stolice a během 8denního období studie byla pozorována účinná clearance RuDA a RuDA-NP, což znamená, že RuDA a RuDA-NP mohou účinně eliminovat z těla bez dlouhodobé toxicity.
A. Ex vivo distribuce RuDA-NP v myších tkáních byla stanovena obsahem Ru (procento podané dávky Ru (ID) na gram tkáně) v různých časech po injekci.Data jsou průměr ± standardní odchylka (n = 3). Nepárové, oboustranné t testy *p < 0,05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. Nepárové, oboustranné t testy *p < 0,05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 a ***p <0,001. Nepárové dvoustranné t-testy *p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 a ***p <0,001. Nepárové dvoustranné t-testy *p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001.B PA snímky in vivo nádorových míst při excitaci 808 nm po intravenózním podání RuDA-NP (10 umol kg-1) v různých časových bodech.Po intravenózním podání RuDA NP (10 µmol kg-1) byl C Ru vylučován z myší močí a stolicí v různých časových intervalech.Data jsou průměr ± standardní odchylka (n = 3).
Zahřívací kapacita RuDA-NP in vivo byla studována na nahých myších s nádory MDA-MB-231 a RuDA pro srovnání.Jak je znázorněno na Obr.8A a doplňkový obr. 32, kontrolní (fyziologický roztok) skupina vykazovala menší změnu teploty (AT ≈ 3 °C) po 10 minutách nepřetržité expozice.Teplota RuDA-NP a RuDA se však rychle zvýšila s maximálními teplotami 55,2 a 49,9 °C, v daném pořadí, což poskytuje dostatečnou hypertermii pro léčbu rakoviny in vivo.Pozorované zvýšení vysoké teploty u RuDA NP (ΔT ≈ 24°C) ve srovnání s RuDA (ΔT ≈ 19°C) může být způsobeno jeho lepší permeabilitou a akumulací v nádorových tkáních díky EPR efektu.
Infračervené termální snímky myší s nádory MDA-MB-231 ozářenými 808 nm laserem v různých časech 8 hodin po injekci.Jsou ukázány reprezentativní snímky čtyř biologických repetic z každé skupiny.B Relativní objem nádoru a C Průměrná hmotnost nádoru různých skupin myší během léčby.D Křivky tělesných hmotností různých skupin myší.Ozařujte laserem o vlnové délce 808 nm výkonem 0,5 W/cm2 po dobu 10 minut (300 J/cm2).Chybové úsečky, průměr ± standardní odchylka (n = 3). Nepárové, oboustranné t testy *p < 0,05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. Nepárové, oboustranné t testy *p < 0,05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 a ***p <0,001. Nepárové dvoustranné t-testy *p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 a ***p <0,001. Nepárové dvoustranné t-testy *p<0,05, **p<0,01 a ***p<0,001. E H&E barvící snímky hlavních orgánů a nádorů z různých léčebných skupin, včetně skupin fyziologický roztok, fyziologický roztok + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NP a RuDA-NP + laser. E H&E barvící snímky hlavních orgánů a nádorů z různých léčebných skupin, včetně skupin fyziologický roztok, fyziologický roztok + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NP a RuDA-NP + laser. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. E H&E barvící snímky hlavních orgánů a nádorů z různých léčebných skupin, včetně skupin fyziologický roztok, fyziologický roztok + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NP a RuDA-NP + laser.来自 不同 治疗 组 的 主要 器官 和 的 的 E H & E 染色 ， 包括 盐水 水 水 + 激光 、 Ruda 、 Ruda + 激光 、 Ruda-nps 和 Ruda-nps + 激光组。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. E H&E barvení hlavních orgánů a nádorů z různých léčebných skupin včetně fyziologického roztoku, fyziologického roztoku + laseru, RuDA, RuDA + laseru, RuDA-NP a RuDA-NP + laseru.Měřítko: 60 µm.
Byl hodnocen účinek fototerapie in vivo s RuDA a RuDA NP, ve které byly nahým myším s nádory MDA-MB-231 intravenózně injikovány RuDA nebo RuDA NP v jedné dávce 10,0 µmol kg-1 přes ocasní žílu a poté 8 hodin po injekci.laserové ozařování o vlnové délce 808 nm.Jak je znázorněno na obrázku 8B, objemy nádorů byly významně zvýšeny ve skupinách s fyziologickým roztokem a laserem, což ukazuje, že ozařování fyziologickým roztokem nebo laserem 808 mělo malý účinek na růst nádoru.Stejně jako ve skupině s fyziologickým roztokem byl také pozorován rychlý růst nádoru u myší léčených RuDA-NP nebo RuDA v nepřítomnosti laserového ozařování, což prokazuje jejich nízkou toxicitu ve tmě.Na rozdíl od toho, po laserovém ozáření, léčba RuDA-NP i RuDA vyvolala významnou regresi nádoru se snížením objemu nádoru o 95,2 % a 84,3 %, v tomto pořadí, ve srovnání se skupinou léčenou fyziologickým roztokem, což ukazuje na vynikající synergickou PDT., zprostředkované RuDA/CHTV efektem.– NP nebo Ruda Ve srovnání s RuDA vykazovaly RuDA NP lepší fototerapeutický efekt, což bylo způsobeno především EPR efektem RuDA NP.Výsledky inhibice růstu nádoru byly dále hodnoceny vyříznutím hmotnosti nádoru v den 15 léčby (obr. 8C a doplňkový obr. 33).Průměrná hmotnost nádoru u myší léčených RuDA-NP a myší léčených RuDA byla 0,08 a 0,27 g, v daném pořadí, což bylo mnohem lehčí než v kontrolní skupině (1,43 g).
Kromě toho byla každé tři dny zaznamenávána tělesná hmotnost myší pro studium temné toxicity RuDA-NP nebo RuDA in vivo.Jak je znázorněno na obrázku 8D, u všech léčených skupin nebyly pozorovány žádné významné rozdíly v tělesné hmotnosti. Dále bylo provedeno barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) hlavních orgánů (srdce, játra, slezina, plíce a ledviny) z různých léčebných skupin. Dále bylo provedeno barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) hlavních orgánů (srdce, játra, slezina, plíce a ledviny) z různých léčebných skupin. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. Kromě toho bylo provedeno barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) hlavních orgánů (srdce, játra, slezina, plíce a ledviny) z různých léčebných skupin.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏剌肾脏）进行一仌伉エ行蓼伉进行一伉进行蓼伉进行一 (ON) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. Kromě toho bylo v různých léčebných skupinách provedeno barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) hlavních orgánů (srdce, játra, slezina, plíce a ledviny).Jak je znázorněno na Obr.8E, snímky H&E barvení pěti hlavních orgánů ze skupin RuDA-NP a RuDA nevykazují žádné zjevné abnormality nebo poškození orgánů. 8E, snímky H&E barvení pěti hlavních orgánů ze skupin RuDA-NP a RuDA nevykazují žádné zjevné abnormality nebo poškození orgánů.Jak je znázorněno na Obr.8e, изображения окрашиваději H&E пяти основных органов из групп Ruda-nps и Ruda ио а а а а а а а а а а а а. 8E, H&E barvené snímky pěti hlavních orgánů ze skupin RuDA-NP a RuDA nevykazují žádné zjevné orgánové abnormality nebo léze.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有娘示凟嘚嘸悼夼嘸悼夼嘸悼如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Как показано на рисунке 8e, изображения окрашиваниdělá Jak je znázorněno na obrázku 8E, snímky H&E barvení pěti hlavních orgánů ze skupin RuDA-NP a RuDA nevykazovaly žádné zjevné abnormality nebo poškození orgánů.Tyto výsledky ukázaly, že ani RuDA-NP ani RuDA nevykazovaly známky toxicity in vivo. Kromě toho snímky barvení nádorů H&E ukázaly, že jak skupiny RuDA + Laser, tak RuDA-NP + Laser by mohly způsobit závažnou destrukci rakovinných buněk, což prokazuje vynikající in vivo fototerapeutickou účinnost RuDA a RuDA-NP. Kromě toho snímky barvení nádorů H&E ukázaly, že jak skupiny RuDA + Laser, tak RuDA-NP + Laser by mohly způsobit závažnou destrukci rakovinných buněk, což prokazuje vynikající in vivo fototerapeutickou účinnost RuDA a RuDA-NP.Kromě toho snímky nádorů obarvené hematoxylinem-eosinem ukázaly, že jak skupiny RuDA+Laser, tak skupiny RuDA-NPs+Laser mohou vyvolat závažnou destrukci rakovinných buněk, což prokazuje vynikající fototerapeutickou účinnost RuDA a RuDA-NP in vivo.此外 ， 肿瘤 的 H&E 染色 图像 ， ， Ruda + Laser 和 Ruda-NPS + laser 组均 导致 严重 的 破坏 ， 证明 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 了 和 和 Ruda-nps 的 优异 的 体内 光疗 功效。。 的 体内 光疗 光疗 光疗 体内 体内 体内 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗 光疗此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， Ruda + Laser 和 Ruda-NPS + Laser 组均 的 癌 破坏 ， 证明 了 Ruda 和 Ruda-nps 的 的 体内 光疗 。。。。。。。。。。。。。 ...Kromě toho snímky nádorů obarvené hematoxylinem a eosinem ukázaly, že jak skupiny RuDA+Laser, tak skupiny RuDA-NPs+Laser vedly k těžké destrukci rakovinných buněk, což prokázalo vynikající fototerapeutickou účinnost RuDA a RuDA-NP in vivo.
Závěrem lze říci, že organokovový komplex Ru(II)-aren (RuDA) s ligandy typu DA byl navržen pro usnadnění procesu ISC pomocí agregační metody.Syntetizovaný RuDA se může samosestavit prostřednictvím nekovalentních interakcí za vzniku supramolekulárních systémů odvozených od RuDA, čímž usnadňuje tvorbu 1O2 a účinnou fototermální konverzi pro léčbu rakoviny vyvolanou světlem.Je pozoruhodné, že monomerní RuDA nevytvářela 1O2 při laserovém ozařování při 808 nm, ale mohla generovat velké množství 1O2 v agregovaném stavu, což dokazuje racionalitu a účinnost našeho návrhu.Následné studie ukázaly, že supramolekulární sestava poskytuje RuDA zlepšené fotofyzikální a fotochemické vlastnosti, jako je absorpce červeného posuvu a odolnost proti fotobělení, které jsou vysoce žádoucí pro zpracování PDT a PTT.Experimenty in vitro i in vivo ukázaly, že RuDA NP s dobrou biokompatibilitou a dobrou akumulací v nádoru vykazují vynikající protirakovinnou aktivitu indukovanou světlem po ozáření laserem o vlnové délce 808 nm.RuDA NP jako účinná bimodální supramolekulární PDT/PTW činidla tedy obohatí sadu fotosenzitizérů aktivovaných při vlnových délkách nad 800 nm.Koncepční návrh supramolekulárního systému poskytuje účinnou cestu pro fotosenzibilizátory aktivované NIR s vynikajícími fotosenzibilizačními účinky.
Všechny chemikálie a rozpouštědla byly získány od komerčních dodavatelů a použity bez dalšího čištění.RuCl3 byl zakoupen od Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, Čína).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenanthrolin-5,6-dion) a 4,7-bis[4-(N,N-difenylamino)fenyl]-5 ,6-Diamino-2,1,3-benzothiadiazol byl syntetizován podle předchozích studií64,65.NMR spektra byla zaznamenána na spektrometru Bruker Avance III-HD 600 MHz v analytickém testovacím centru Southeastern University za použití d6-DMSO nebo CDC13 jako rozpouštědla.Chemické posuny 5 jsou uvedeny v ppm.s ohledem na tetramethylsilan a interakční konstanty J jsou uvedeny v absolutních hodnotách v hertzech.Hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením (HRMS) byla provedena na přístroji Agilent 6224 ESI/TOF MS.Elementární analýza C, H a N byla provedena na elementárním analyzátoru Vario MICROCHNOS (Elementar).UV-viditelná spektra byla měřena na spektrofotometru Shimadzu UV3600.Fluorescenční spektra byla zaznamenána na spektrofluorimetru Shimadzu RF-6000.EPR spektra byla zaznamenána na přístroji Bruker EMXmicro-6/1.Morfologie a struktura připravených vzorků byla studována na přístrojích FEI Tecnai G20 (TEM) a Bruker Icon (AFM) pracujících při napětí 200 kV.Dynamický rozptyl světla (DLS) byl proveden na analyzátoru Nanobrook Omni (Brookhaven).Fotoelektrochemické vlastnosti byly měřeny na elektrochemickém zařízení (CHI-660, Čína).Fotoakustické snímky byly získány pomocí systému FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.Konfokální snímky byly získány pomocí konfokálního mikroskopu Olympus FV3000.Analýza FACS byla provedena na průtokovém cytometru BD Calibur.Experimenty s vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) byly provedeny na systému Waters Alliance e2695 s použitím detektoru 2489 UV/Vis.Testy gelové permeační chromatografie (GPC) byly zaznamenány na přístroji Thermo ULTIMATE 3000 s použitím detektoru indexu lomu ERC RefratoMax520.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenanthrolin-5,6-dion)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4-(N, N-difenylamino)fenyl]-5,6-diamino-2,1,3-benzothiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) a ledová kyselina octová (30 ml) byly míchány při teplotě varu pod zpětným chladičem po dobu 12 hodin.Rozpouštědlo bylo poté odstraněno ve vakuu za použití rotační odparky.Výsledný zbytek byl purifikován flash sloupcovou chromatografií (silikagel, CH2CI2:MeOH = 20:1) za získání RuDA jako zeleného prášku (výtěžek: 877,5 mg, 80 %).řitní otvor.Vypočteno pro C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Nalezeno: C 67,92, H 4,26, N 9,82.'H NMR (600 MHz, d6-DMSO) 5 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13C NMR (150 MHz, D6-DMSO), δ (ppm) 158,03, 152,81, 149,31, 147,98, 147,16, 139,98, 136,21, 135,57, 134,68, 130,34, 130,02, 128,51, 124,45, 120,51, 124,45, 120,51, 124,45, 120,51, 124,45, 120,51, 124,45, 120,51, 124,45, 120,51, 124,45, 120,51, 124,45, 120,51, 1281, 120,51, 128,02 , 103, 86,52, 84,75, 63,29, 30,90, 22,29, 18,83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Syntéza 4,7-bis[4-(N,N-diethylamino)fenyl-5,6-diamino-2,1,3-benzothiadiazolu (L2): L2 byl syntetizován ve dvou krocích.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) byl přidán k N,N-diethyl-4-(tributylstannyl)anilinu (1,05 g, 2,4 mmol) a 4,7-dibrom-5,6-dinitro roztoku - 2, 1,3-benzothiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) v suchém toluenu (100 ml).Směs byla míchána při 100 °C po dobu 24 hodin.Po odstranění toluenu ve vakuu byla výsledná pevná látka promyta petroletherem.Potom se směs této sloučeniny (234,0 mg, 0,45 mmol) a práškového železa (0,30 g, 5,4 mmol) v kyselině octové (20 ml) míchá při 80 °C po dobu 4 hodin.Reakční směs se nalije do vody a výsledná hnědá pevná látka se sebere filtrací.Produkt byl dvakrát přečištěn vakuovou sublimací, čímž byla získána zelená pevná látka (126,2 mg, 57% výtěžek).řitní otvor.Vypočteno pro C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Nalezeno: C 67,84, H 6,95, H 18,16.'H NMR (600 MHz, CDC13), 5 (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13C NMR (150 MHz, CDC13), 5 (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Sloučeniny byly připraveny a purifikovány podle postupů podobných RuDA.řitní otvor.Vypočteno pro C48H48CI2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Nalezeno: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81,1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), 5 (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13C NMR (151 MHz, CDCL3), δ (ppm) 158,20, 153,36, 148,82, 148,14, 138,59, 136,79, 135,75, 134,71, 130,44, 128,87, 128,35, 121,70, 111,84, 110,76, 85,07, 104,44, 85,07, 104,44, 85,07, 104,44, 105,07, 104,44, 128,35, 105,07, 104,44, 128,35, 1044, 10444, 128,76, 844, 128,76., 38,06, 31,22, 29,69, 22,29, 19,19, 14,98, 12,93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA byl rozpuštěn v MeOH/H2O (5/95, obj./obj.) v koncentraci 10 uM.Absorpční spektrum RuDA bylo měřeno každých 5 minut na spektrofotometru Shimadzu UV-3600 za ozařování laserovým světlem o vlnové délce 808 nm (0,5 W/cm2).ICG spektra byla zaznamenána za stejných podmínek jako standard.
Spektra EPR byla zaznamenána na spektrometru Bruker EMXmicro-6/1 s mikrovlnným výkonem 20 mW, rozsahem skenování 100 G a modulací pole 1 G. 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidon (TEMP) a 5,5-dimethyl-1-pyrrolin-N-oxid (DMPO) byly použity jako odstředivé pasti.Spektra elektronové spinové rezonance byla zaznamenána pro směsné roztoky RuDA (50 uM) a TEMF (20 mM) nebo DMPO (20 mM) za působení laserového záření o vlnové délce 808 nm (0,5 W/cm2).
Výpočty DFT a TD-DFT pro RuDA byly provedeny na hladinách PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ ve vodném roztoku pomocí Gaussova programu 1666,67,68.Pomocí programu GaussView (verze 5.0) byla vynesena HOMO-LUMO, dírová a elektronová distribuce excitovaného stavu nízkoenergetického singletu RuDA.
Nejprve jsme se pokusili změřit účinnost generování 1O2 RuDA pomocí konvenční UV-viditelné spektroskopie s ICG (ΦΔ = 0,002) jako standardu, ale výsledky silně ovlivnila fotodegradace ICG.Kvantový výtěžek 1O2 RuDA byl tedy měřen detekcí změny intenzity fluorescence ABDA při asi 428 nm při ozáření laserem o vlnové délce 808 nm (0,5 W/cm2).Experimenty byly prováděny na RuDA a RuDA NP (20 μM) ve vodě/DMF (98/2, v/v) obsahujícím ABDA (50 μM).Kvantový výtěžek 1O2 byl vypočten pomocí následujícího vzorce: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS a rICG jsou reakční rychlosti ABDA s 102 získané z fotosenzibilizátoru a ICG, v daném pořadí.APS a AICG jsou absorbance fotosenzibilizátoru a ICG při 808 nm.
AFM měření byla prováděna v kapalných podmínkách za použití skenovacího režimu na systému Bruker Dimension Icon AFM.Za použití otevřené struktury s kapalnými buňkami byly buňky dvakrát promyty ethanolem a vysušeny proudem dusíku.Vložte vysušené buňky do optické hlavy mikroskopu.Ihned kápněte kapku vzorku do kaluže kapaliny a umístěte ji na konzolu pomocí sterilní plastové stříkačky na jedno použití a sterilní jehly.Další kapka se umístí přímo na vzorek a při sklopení optické hlavy se obě kapky spojí a vytvoří meniskus mezi vzorkem a nádržkou na kapalinu.AFM měření byla provedena pomocí SCANASYST-FLUID nitridové konzoly tvaru V (Bruker, tvrdost k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
HPLC chromatogramy byly získány na systému Waters e2695 vybaveném kolonou phoenix C18 (250 x 4,6 mm, 5 um) za použití detektoru 2489 UV/Vis.Vlnová délka detektoru je 650 nm.Mobilní fáze A a B byly voda a methanol a průtok mobilní fáze byl 1,0 ml.min-1.Gradient (rozpouštědlo B) byl následující: 100 % od 0 do 4 minut, 100 % až 50 % od 5 do 30 minut a reset na 100 % od 31 do 40 minut.Ruda byla rozpuštěna ve směsném roztoku methanolu a vody (50/50, objemově) v koncentraci 50 uM.Objem nástřiku byl 20 μl.
GPC testy byly zaznamenány na přístroji Thermo ULTIMATE 3000 vybaveném dvěma PL kolonami aquagel-OH MIXED-H (2x300x7,5 mm, 8 um) a detektorem indexu lomu ERC RefratoMax520.GPC kolona byla eluována vodou při průtoku 1 ml/min při 30 °C.Rudné NP byly rozpuštěny v roztoku PBS (pH = 7,4, 50 μM), injekční objem byl 20 μl.
Fotoproudy byly měřeny na elektrochemickém zařízení (CHI-660B, Čína).Optoelektronické odezvy při zapnutí a vypnutí laseru (808 nm, 0,5 W/cm2) byly měřeny při napětí 0,5 V v černém poli.Byl použit standardní tříelektrodový článek s elektrodou ze skelného uhlíku ve tvaru L (GCE) jako pracovní elektrodou, standardní kalomelovou elektrodou (SCE) jako referenční elektrodou a platinovým diskem jako protielektrodou.Jako elektrolyt byl použit 0,1 M roztok Na2S04.
Lidská buněčná linie rakoviny prsu MDA-MB-231 byla zakoupena od KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, Čína, katalogové číslo: KG033).Buňky byly pěstovány v monovrstvách v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM, vysoká glukóza) doplněném roztokem 10% fetálního bovinního séra (FBS), penicilinem (100 μg/ml) a streptomycinem (100 μg/ml).Všechny buňky byly kultivovány při 37 °C ve vlhké atmosféře obsahující 5 % C02.
Test MTT byl použit ke stanovení cytotoxicity RuDA a RuDA-NP v přítomnosti a nepřítomnosti světelného záření, s nebo bez Vc (0,5 mM).Rakovinové buňky MDA-MB-231 byly pěstovány v 96-jamkových destičkách při buněčné hustotě přibližně 1 x 105 buněk/ml/jamka a inkubovány po dobu 12 hodin při 37,0 °C v atmosféře 5 % CO2 a 95 % vzduchu.K buňkám byly přidány RuDA a RuDA NP rozpuštěné ve vodě.Po 12 hodinách inkubace byly buňky vystaveny 0,5 W cm-2 laserovému záření o vlnové délce 808 nm po dobu 10 minut (300 J cm-2) a poté inkubovány ve tmě po dobu 24 hodin.Buňky byly poté inkubovány s MTT (5 mg/ml) dalších 5 hodin.Nakonec vyměňte médium za DMSO (200 µl), aby se rozpustily výsledné purpurové krystaly formazanu.Hodnoty OD byly měřeny pomocí čtečky mikrodestiček s vlnovou délkou 570/630 nm.Hodnota IC50 pro každý vzorek byla vypočtena pomocí softwaru SPSS z křivek dávka-odpověď získaných z alespoň tří nezávislých experimentů.
Buňky MDA-MB-231 byly ošetřeny RuDA a RuDA-NP v koncentraci 50 uM.Po 12 hodinách inkubace byly buňky ozářeny laserem s vlnovou délkou 808 nm a výkonem 0,5 W/cm2 po dobu 10 min (300 J/cm2).Ve skupině vitaminu C (Vc) byly buňky ošetřeny 0,5 mM Vc před laserovým ozářením.Buňky byly poté inkubovány ve tmě dalších 24 hodin, poté byly obarveny calceinem AM a propidium jodidem (20 μg/ml, 5 μl) po dobu 30 minut, poté promyty PBS (10 μl, pH 7,4).obrázky obarvených buněk.