Zprávy

Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Rakovinné buňky si vyvinuly různé mechanismy, jak překonat buněčný stres a pokračovat v pokroku.Proteinkináza R (PKR) a její proteinový aktivátor (PACT) jsou prvotními respondéry, které monitorují různé stresové signály vedoucí k inhibici buněčné proliferace a apoptózy.Regulace dráhy PACT-PKR v rakovinných buňkách však zůstává velkou neznámou.Zde jsme zjistili, že dlouhá nekódující RNA (lncRNA) aspartyl tRNA syntetáza antisense RNA 1 (DARS-AS1) se přímo podílí na inhibici dráhy PACT-PKR a podporuje proliferaci rakovinných buněk.Pomocí rozsáhlého funkčního screeningu lncRNA spojené s rakovinou CRISPRi 971 jsme zjistili, že DARS-AS1 byl spojen s významně zvýšenou proliferací rakovinných buněk.Proto knockout DARS-AS1 inhibuje buněčnou proliferaci a podporuje apoptózu rakovinných buněk v různých rakovinných buněčných liniích in vitro a významně snižuje růst nádoru in vivo.Mechanicky se DARS-AS1 váže přímo na aktivační doménu PACT a zabraňuje interakci PACT-PKR, čímž snižuje aktivaci PKR, fosforylaci eIF2a a inhibuje apoptotickou buněčnou smrt.Klinicky je DARS-AS1 široce exprimován u mnohočetných rakovin a nadměrná exprese této lncRNA ukazuje na špatnou prognózu.Tato studie objasňuje rakovinu specifickou regulaci PACT-PKR dráhy pomocí DARS-AS1 lncRNA a poskytuje další cíl pro prognózu a léčbu rakoviny.
Schopnost adaptovat se na stres je důležitou charakteristikou přežití a proliferace rakovinných buněk.Rychlá proliferace a metabolické znaky rakoviny vrcholí v drsných mikroprostředích – nedostatek živin, hypoxie a nízké pH – které mohou spustit signální dráhy buněčné smrti.Dysregulace genů citlivých na stres, jako je p535, proteiny tepelného šoku 6, 7, KRAS8, 9 a HIF-110, 11, 12, 13, je často pozorována u rakoviny, čímž blokuje apoptózu a podporuje přežití.
Proteinkináza R (PKR) je důležitým senzorem stresu a podjednotkovou kinázou eukaryotického iniciačního faktoru 2α (eIF2α), translačního regulátoru, který spojuje buněčný stres s buněčnou smrtí.PKR byl původně identifikován jako antivirový protein detekcí cizí dvouvláknové RNA (dsRNA).Po aktivaci PKR fosforyluje eIF2α, aby inhiboval syntézu virových a buněčných proteinů14,15,16.PACT (PKR aktivátorový protein) byl identifikován jako první PKR aktivátorový protein v nepřítomnosti dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Prostřednictvím přímé interakce s PKR přenáší PACT různé stresy (hladovění séra, ošetření peroxidem nebo arsenitem) na PKR a následné signální dráhy.Kromě fosforylace eIF2α spouští PACT zprostředkovaná aktivace PKR různé události spojené se stresovou reakcí, včetně změněného redoxního stavu prostřednictvím dráhy PI3K/Akt24, zvýšené kontroly poškození DNA prostřednictvím p5325,26 a NF-κB27,28 Reguluje transkripci, 29. Vzhledem ke své kritické roli v reakci na stres, proliferaci, apoptóze a dalších klíčových buněčných procesech jsou PKR a PACT slibnými terapeutickými cíli pro mnoho nemocí, zejména rakoviny30,31,32,33.Navzdory tomuto pleiotropnímu funkčnímu a biologickému významu však regulace aktivity PACT/PKR v rakovinných buňkách zůstává nepolapitelná.
lncRNA jsou transkripty větší než 200 nukleotidů bez potenciálu pro kódování proteinů.Protože nejmodernější projekty sekvenování celého genomu identifikovaly tisíce lncRNA,35,36 bylo vynaloženo velké úsilí na objasnění jejich biologických funkcí.Rostoucí počet výzkumů ukázal, že lncRNA se účastní mnoha biologických procesů37 včetně regulace inaktivace X-chromozomu38,39, imprintingu40, transkripce41,42, translace43 a dokonce i růstu rakoviny44,45,46,47.Tyto studie uvádějí, že mnoho lncRNA je zapojeno do dráhy PACT/PKR.Jedna taková studie ukázala, že lncRNA ASPACT inhibovala transkripci PACT a zvýšila nukleární retenci PACT mRNA.Jiné studie ukázaly, že lncRNA nc886 se váže na PKR a inhibuje její fosforylaci49,50.Dosud nebyla hlášena lncRNA regulující aktivaci PKR zprostředkovanou PACT.
Aspartyl-tRNA syntetáza antisense RNA 1 (DARS-AS1) byla identifikována jako onkogenní lncRNA51,52,53,54.Prostřednictvím regulace miP-194-5p53, miP-12952 a miP-532-3p51 bylo prokázáno, že DARS-AS1 podporuje růst jasného renálního karcinomu, karcinomu štítné žlázy a nemalobuněčného karcinomu plic, v daném pořadí.Tong a kolegové také zjistili, že DARS-AS1 podporuje progresi myelomu udržováním stability RNA vazebného motivu proteinu 39 (RBM39).Nebyly však provedeny žádné studie o tom, zda se tato lncRNA účastní regulace aktivace PACT-PKR a stresové reakce rakovinných buněk.
Zde jsme provedli rozsáhlý screening ztráty funkce pomocí systému CRISPRi a zjistili jsme, že DARS-AS1 lncRNA podporuje proliferaci několika typů rakovinných buněk.Kromě toho jsme identifikovali hlavní mechanismus: DARS-AS1 se váže přímo na PACT, inhibuje vazbu PACT a PKR, zabraňuje fosforylaci eIF2α, nižšího substrátu PKR, a nakonec inhibuje apoptotickou buněčnou smrt.Na závěr naše práce odhaluje DARS-AS1 lncRNA jako regulátor dráhy PACT-PKR a potenciální cíl pro léčbu a prognózu rakoviny.
Rozsáhlé studie genomového profilování identifikovaly stovky lncRNA asociovaných s rakovinou.Jejich funkce však zůstává velkou neznámou56.Abychom identifikovali slibné kandidáty lncRNA zapojené do progrese rakoviny, provedli jsme screening ztráty funkce na sníženou proliferaci v buněčné linii kolorektálního karcinomu SW620 pomocí systému CRISPRi (obr. 1a).Jedinečným rysem buněčných linií rakoviny tlustého střeva SW480 a SW620 je to, že pocházejí z primárních a sekundárních nádorů u jednoho pacienta.To poskytuje cenné srovnání pro studium genetických změn v progresi pokročilé rakoviny tlustého střeva.Proto jsme analyzovali transkriptomy buněčných linií kolorektálního karcinomu (SW480 a SW620) pomocí sekvenování RNA a shromáždili některé potenciální funkční lncRNA z publikované literatury.Na základě těchto výsledků jsme navrhli sdruženou knihovnu sgRNA obsahující 7355 sgRNA oligo zacílených na 971 lncRNA spojených s rakovinou a 500 necílených sgRNA oligo pro negativní kontrolu (doplňková data 1).
Schematické znázornění screeningu pomocí systému CRISPRi.b obohacení sgRNA po screeningu.Vodorovná tečkovaná čára představuje log2 (násobná změna) = ±0,58.Svislá tečkovaná čára označuje hodnotu p = 0,05.Černé tečky představují necílovou sgRNA (označenou jako NC).Červené tečky jsou sgRNA zacílené na DARS-AS1.Modré tečky jsou sgRNA zacílené na LINC00205, dříve popsanou onkogenní lncRNA.násobná změna = (normalizovaná hodnota, den 17)/(normalizovaná hodnota, den 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown inhiboval buněčný růst.Chybové úsečky představují ± standardní odchylku tří experimentů.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 dvoustranný Studentův t-test.d Exprese DARS-AS1 v nádorech (datový soubor TCGA).em Exprese DARS-AS1 ve spárovaných normálních a nádorových vzorcích od pacientů s BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP a COAD, v tomto pořadí (datový soubor TCGA).p-hodnoty byly získány pomocí párového dvoustranného Studentova t-testu.
Po zkonstruování plazmidu a zabalení lentiviru jsme transdukovali buněčnou linii kolorektálního karcinomu dCas9-SW620 výše uvedenou knihovnou ve čtyřech nezávislých infekčních experimentech.Multiplicita infekce (MOI) pro tyto infekce byla 0,1–0,3, což naznačuje, že každá buňka může být transfekována pouze jednou sgRNA.Po 18 dnech in vitro kultivace se profil obohacení cílových sgRNA po screeningu snížil nebo zvýšil, zatímco počet necílených kontrolních oligonukleotidů zůstal relativně nezměněn ve srovnání s profilem před screeningem, což naznačuje, že náš cíl má vysoce specifický screening. knihovna.Rýže.1b a doplňková tabulka 1). LINC00205, o kterém bylo dříve hlášeno, že podporuje rakovinu plic a progresi rakoviny jater58,59,60, byl vyřazen (log2 (foldchange) < −0,58, hodnota p < 0,05), což potvrzuje spolehlivost tohoto screeningu (obr. 1b). LINC00205, o kterém bylo dříve hlášeno, že podporuje rakovinu plic a progresi rakoviny jater58,59,60, byl vyřazen (log2 (foldchange) < −0,58, hodnota p < 0,05), což potvrzuje spolehlivost tohoto screeningu (obr. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, o kterém bylo dříve hlášeno, že podporuje progresi rakoviny plic a rakoviny jater58,59,60, byl vyloučen (log2 (násobná změna) <-0,58, p-hodnota <0,05), což potvrzuje robustnost tohoto screeningu (obr. .1b). . LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 58,59,60 ， 被 选 掉 LOG2 （变化 变化）））））））））））） 变化 变化）））））））））））））） 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 58,59,60 ， 被 选 掉 LOG2 （变化 变化）））））））））））） 变化 变化）））））））））））））） 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, o kterém bylo dříve hlášeno, že podporuje progresi rakoviny plic a jater58,59,60, byl vyloučen (log2 (násobná změna) <-0,58, p-hodnota <0,05, což potvrzuje robustnost tohoto screeningu (obr. .1b).
Mezi všemi testovanými lncRNA byl také testován DARS-AS1 se třemi příbuznými oligonukleotidy sgRNA významně sníženými po 18 dnech kultivace, což naznačuje, že knockdown této lncRNA vedl ke snížení proliferace rakoviny (obr. 1b).Tento výsledek byl dále podpořen analýzou MTS v buňkách kolorektálního karcinomu, která ukazuje, že rychlost růstu knockdown buněk DARS-AS1 byla pouze poloviční ve srovnání s kontrolními buňkami (obrázek 1c) a byla v souladu s předchozími zprávami o několika dalších typech rakoviny.: jasnobuněčný karcinom ledvin, karcinom štítné žlázy a nemalobuněčný karcinom plic51,52,53,55.Jeho funkce a molekulární mechanismy u kolorektálního karcinomu však zůstávají neprozkoumané.Proto jsme vybrali tuto lncRNA pro další studium.
Pro studium exprese DARS-AS1 u pacientů jsme komplexně analyzovali 10 327 vzorků nádorů z projektu Cancer Genome Atlas (TCGA).Naše výsledky ukazují, že DARS-AS1 je široce exprimován a významně upregulován ve zdravých buňkách u různých nádorů, včetně adenokarcinomu tlustého střeva (COAD), renálního karcinomu z jasných buněk (KIRC) a renálního papilárního karcinomu (KIRP)..Velmi málo (obr. 1d a doplňkový obr. 1a, b). Analýza párových zdravých/nádorových vzorků dále potvrdila signifikantně vyšší expresi DARS-AS1 v nádorech uroteliálního karcinomu močového měchýře (BLCA), ledvinového renálního jasnobuněčného karcinomu (KIRC), adenokarcinomu prostaty (PRAD), spinocelulárního karcinomu plic (LUSC) , karcinom endometria děložního tělíska (UCEC), adenokarcinom plic (LUAD), jaterní hepatocelulární karcinom (LIHC), ledvinový renální papilární karcinom (KIRP) a adenokarcinom tlustého střeva (COAD) (hodnota p < 0,05) (obr. 1e–m) . Analýza párových zdravých/nádorových vzorků dále potvrdila signifikantně vyšší expresi DARS-AS1 v nádorech uroteliálního karcinomu močového měchýře (BLCA), ledvinového renálního jasnobuněčného karcinomu (KIRC), adenokarcinomu prostaty (PRAD), spinocelulárního karcinomu plic (LUSC) , karcinom endometria děložního tělíska (UCEC), adenokarcinom plic (LUAD), jaterní hepatocelulární karcinom (LIHC), ledvinový renální papilární karcinom (KIRP) a adenokarcinom tlustého střeva (COAD) (hodnota p < 0,05) (obr. 1e–m) .Analýza párových zdravých/nádorových vzorků také potvrdila signifikantně vyšší expresi DARS-AS1 v nádorech uroteliálního karcinomu močového měchýře (BLCA), karcinomu ledvin a ledvin z jasných buněk (KIRC), adenokarcinomu prostaty (PRAD), spinocelulárního karcinomu plic (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , endometriální karcinom corpus uteri (UCEC), adenokarcinom plic (LUAD), hepatocelulární karcinom jater (LIHC), papilární karcinom ledviny (KIRP) a adenokarcinom tlustého střeva (COAD) (hodnota p < 0,05) (obr. 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 DARS-AS1 在 膀胱 尿路 皮癌 皮癌 (BLCA) 、 肾 透明 细胞癌 细胞癌 、 、 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 、 肺鳞状 细胞癌 (LUSC) 肿瘤 中 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （UCEC） ， 肺腺癌 （LUAD） ， 肝肝 （LIHC） ， 肾 肾 乳头状 细胞癌 （KIRP） 和结肠腺癌 （Coad） （P 值 P 值<0,05））(图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 DARS-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 表达 ， 内膜 癌 （Ucel） 肺腺癌 （LUAD） 肝肝 细胞癌 （（（肾 肾 肾 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 肾 乳头状 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 肾 （癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）） (图1e-m) .Analýza párových vzorků zdravých/nádorových dále podpořila úlohu DARS-AS1 v nádorech uroteliálního karcinomu močového měchýře (BLCA), karcinomu ledvin z jasných buněk (KIRC), adenokarcinomu prostaty (PRAD) a karcinomu skvamózních buněk plic (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). exprese u karcinomu děložního tělíska (UCEC), plicního adenokarcinomu (LUAD), hepatocelulárního karcinomu (LIHC), renálního papilárního buněčného karcinomu (KIRP) a adenokarcinomu tlustého střeva (COAD) (hodnota p <0,05) (obrázek 1e-m).Celkově tyto výsledky naznačují, že DARS-AS1 je široce a vysoce exprimován u různých druhů rakoviny.
Protože DARS-AS1 a DARS (gen kódující antisense řetězec) sdílejí stejný promotor a jsou umístěny vedle sebe, navrhli jsme shRNA tak, aby specificky knockdownovala DARS-AS1, ale ne DARS (doplňkový obr. 2a,b a doplňková tabulka 2) .Kromě SW620 jsme také použili tři další buněčné linie vysoce exprimující DARS-AS1 ke studiu účinnosti a funkce knockdownu shRNA (doplňková tabulka 3).Naše výsledky ukázaly, že všechny tři vyvinuté shRNA dosáhly alespoň 80% DARS-AS1 knockdown účinnosti s malým vlivem na množství DARS mRNA (doplňkový obr. 2c–f).Kromě toho jsme zjistili, že knockdown DARS-AS1 s těmito shRNA významně inhiboval buněčný růst v buněčných liniích kolorektálního karcinomu SW620 (49,7 %) a HCT116 (27,7 %), buněčné linii rakoviny prsu MBA-MD-231 (53,4 %).) a buněčná linie HepG2 hepatomu (92,7% snížení), stejně jako jejich schopnost tvořit neukotvené koule (průměrné snížení ~50,8 %, 44,6 %, 40,7 % a 75,7 % na buněčnou linii) (obr. 2a,b).U SW620 výsledky testu tvorby kolonií dále potvrdily, že DARS-AS1 shRNA významně inhibovala buněčnou proliferaci s průměrným poklesem přibližně 69,6 % (obr. 2c).
Vliv kontrolní shRNA a DARS-AS1 shRNA na buněčnou proliferaci (a) a tvorbu sféroidů (b) v buňkách SW620, HCT116, MBA-MD-231 a HepG2.c Vliv kontrolní shRNA a DARS-AS1 shRNA na tvorbu kolonií v buňkách SW620.Buněčná proliferace (d), tvorba sféroidů (e) a tvorba kolonií (f) buněk SW620 nadměrně exprimujících DARS-AS1.Uvedená data jsou průměr ± standardní odchylka ze tří experimentů.* p < 0,05, ** p < 0,01 a*** p < 0,001 pomocí dvoustranného Studentova t-testu.
Pro doplnění studií ztráty funkce jsme dále vytvořili buňky SW620 nadměrně exprimující DARS-AS1 (doplňkový obrázek 2g).Nadměrná exprese DARS-AS1 významně zvýšila buněčný růst (1,8krát), tvorbu neukotvených sféroidů (1,4krát) a tvorbu kolonií (3,3krát) v buňkách SW620 (obr. 2d–f).Tento výsledek jsme potvrdili použitím další buněčné linie exprimující DARS-AS1, A549.Tato zvýšená buněčná proliferace v důsledku nadměrné exprese DARS-AS1 byla dále pozorována u buněk A549 (doplňkový obrázek 2h, i a doplňková tabulka 3).Dohromady tyto studie zisků a ztrát ukazují, že DARS-AS1 podporuje proliferaci rakovinných buněk in vitro.
Abychom prozkoumali základní mechanismus, kterým DARS-AS1 reguluje buněčnou proliferaci, provedli jsme analýzu RNA pull-down, abychom identifikovali její potenciální partnery vázající proteiny.Výsledky RT-qPCR ukázaly, že asi 86,2 % DARS-AS1 se nachází v cytoplazmě buněk SW620 (doplňkový obrázek 3a).In vitro transkribovaná biotinylovaná DARS-AS1 nebo pseudoRNA byla poté inkubována s buněčnými lyzáty SW620 s následnou separací SDS-PAGE.Následné barvení stříbrem ukázalo, že zřetelný pás (~38 kDa) byl významně obohacen ve vzorcích DARS-AS1 pull, ale ne ve vzorcích fiktivní RNA nebo kuliček (obr. 3a).Tento pás byl identifikován jako protein aktivující PKR (PACT) hmotnostní spektrometrií (MS) a dále potvrzen imunoblotem v buněčných liniích SW620, HCT116 a HepG2 (obr. 3a, b).Obohacení DARS a příbuzných proteinů PACT – PKR a TRBP – bylo také zkoumáno pomocí analýzy RNA metodou Western blotting (WB).Výsledky ukázaly, že nebyla nalezena žádná přímá interakce mezi DARS-AS1 RNA a těmito třemi proteiny (doplňkový obrázek 3b).Specifická interakce mezi DARS-AS1 a PACT byla dále potvrzena analýzou imunoprecipitace RNA (RIP), která ukázala, že DARS-AS1 byl významně obohacen o protilátky anti-PACT, ale ne o jiné kontrolní RNA (obrázek 3c).Aby se určilo, zda DARS-AS1 interaguje přímo s PACT v nepřítomnosti jakýchkoli jiných buněčných složek, byl proveden test in vitro biovrstvy interferometrie (BLI) s použitím purifikovaného PACT.Biotinem značená DARS-AS1 nebo fiktivní RNA byla imobilizována na streptavidinových (SA) biosenzorech a poté inkubována v kinetickém pufru obsahujícím 1 uM PACT.Je pozoruhodné, že PACT se silně vázal na DARS-AS1 (hodnota KD ~26,9 nM), ale ne napodoboval RNA (obrázek 3d).Dohromady tyto výsledky ukazují přímou interakci a vysokou afinitu mezi DARS-AS1 a PACT.
Analýza RNA pull identifikovala DARS-AS1 interagující s PACT v buňkách SW620.Nahoře stříbřité barvení příbuzných proteinů.Nižší imunobloty byly provedeny s anti-PACT protilátkou.b Analýza pull-down RNA byla provedena v buňkách HCT116 (nahoře) a HepG2 (dole).Obohacení PACT bylo detekováno imunoblotem.Testy imunoprecipitace cRNA (RIP) byly provedeny v buňkách SW620 s použitím uvedených protilátek.d PACT vazebné křivky k DARS-AS1 plné délky nebo kontrolní RNA byly získány pomocí interferometrie biovrstvy (BLI).RNA byla imobilizována na streptavidinovém biosenzoru.K měření asociace byl použit 1 μM PACT.Test RNA pull byl proveden s použitím biotinylovaného DARS-AS1 plné délky nebo zkráceného (nahoře).Imunoblot ukazující přijatý PACT (dole).f Purifikovaný označený PACT byl inkubován s biotinylovaným DARS-AS1 plné délky nebo zkrácen (jako v e) pro in vitro RIP test.Extrahovaná RNA byla ověřena pomocí RT-qPCR.g Relativní afinita různých fragmentů RNA pro PACT byla získána pomocí interferometrie biovrstvy.Pro analýzu bylo použito 100 nM RNA a 1 uM RAST.h Testy RIP in vitro byly provedeny za použití purifikovaného intaktního nebo zkráceného značeného PACT.Extrahovaná RNA byla ověřena pomocí RT-qPCR.i Rychlost růstu buněk SW620 nadměrně exprimujících DARS-AS1, PACT nebo obojí.j Nadměrná exprese DARS-AS1 plné délky nebo zkráceného DARS-AS1 v buňkách SW620 měla různé účinky na buněčný růst.k Apoptóza byla detekována imunoblotováním s anti-PARP protilátkou.l Knockout DARS-AS1 indukuje apoptózu buněk SW620, jak ukazuje průtoková cytometrie.Uvedená data jsou průměr ± standardní odchylka ze tří experimentů. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, pomocí dvoustranného Studentova t testu. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, pomocí dvoustranného Studentova t testu. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 dvoustranným Studentovým t-testem. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 dvoustranným Studentovým t-testem.
Poté jsme vytvořili tři biotinylované fragmenty DARS-AS1 RNA in vitro transkripcí, abychom identifikovali oblast DARS-AS1 potřebnou pro asociaci PACT (obrázek 3e).Výsledky analýzy RNA ukázaly, že každý fragment byl schopen interagovat s PACT, ale 3′-terminální oblast (384–768 nukleotidů značených A3) vykazovala více než 1–384 nukleotidů značených A1) (obr. 3e).Podobné výsledky byly pozorovány v in vitro RIP testu s použitím rekombinantního PACT (obrázek 3f).V souladu s těmito výsledky experimenty s navázáním imobilizovaných fragmentů RNA na PACT pomocí BLI také ukázaly, že PACT má vyšší afinitu k A3 (384–768 nt) (hodnota KD přibližně 94,6 nM), zatímco téměř žádné vazby s jinými oblastmi.(Obr. 3d).
Také jsme zkoumali asociované vazebné oblasti v PACT.PACT obsahuje tři funkční domény, z nichž dvě jsou konzervované dvouvláknové RNA-vazebné domény (dsRBD) a třetí doménu (označenou D3), která působí jako aktivátor proteinových interakcí.Abychom prozkoumali vazebnou kapacitu lncRNA každé domény, vytvořili jsme tři mutace, které odstranily každou ze tří domén, a provedli in vitro RIP test.Naše výsledky ukázaly, že delece třetí domény (D3) PACT významně snížila jeho interakci s DARS-AS1 (0,11krát ve srovnání s intaktním PACT) ve srovnání s dalšími dvěma mutacemi (obr. 3h), bylo prokázáno, že uvolnění z D3 interagoval s DARS.-AC1.Dohromady tyto výsledky naznačují, že k interakci mezi DARS-AS1 a PACT může docházet primárně prostřednictvím 3' konce DARS-AS1 a domény D3 PACT.
Zaznamenali jsme, že DARS-AS1 neměl žádný účinek na expresi PACT a PACT neměl žádný účinek na DARS-AS1 (doplňkový obrázek 3c).Poté jsme zkoumali účinek knockdownu PACT na buněčný růst.Na rozdíl od DARS-AS1 rostly relativní buňky 1,5–3krát rychleji, když byl PACT sražen (doplňkový obrázek 3d).Výsledky testu tvorby kolonií ukázaly, že buňky vytvořily 2-3násobné kolonie po ošetření shRNA pomocí PACT (doplňkový obrázek 3e).Abychom otestovali, zda DARS-AS1 reguluje buněčnou proliferaci prostřednictvím PACT, vytvořili jsme buňky SW620 nadměrně exprimující PACT, DARS-AS1 nebo obojí.Nadměrná exprese PACT ukázala významnou inhibici buněčné proliferace (obrázek 3i).Zatímco nadměrná exprese DARS-AS1 per se významně podporovala buněčnou proliferaci, nebyl žádný významný rozdíl v rychlosti růstu buněk nadměrně exprimujících DARS-AS1 a PACT.Tyto výsledky naznačují, že PACT může působit proti zvýšené proliferaci způsobené nadměrnou expresí DARS-AS1.
Protože různé oblasti DARS-AS1 mají různé PACT-vazebné schopnosti, zkoumali jsme jejich relativní vliv na buněčnou proliferaci prostřednictvím různé nadměrné exprese fragmentů DARS-AS1.Ve srovnání s dalšími dvěma fragmenty byl DARS-AS1 nadměrně exprimován na 3′ konci (384–768 nt), hlavní oblasti související s PACT v DARS-AS1, která měla nejvyšší schopnost stimulovat buněčnou proliferaci (obr. 3j).Tyto výsledky naznačují pozitivní korelaci mezi vazebnou kapacitou a biologickou funkcí DARS-AS1.
Bylo popsáno, že PACT je proapoptotický protein19.Proto jsme zkoumali účinek DARS-AS1 na apoptózu.Jak se očekávalo, knockdown DARS-AS1 významně zvýšil štěpení PARP v buňkách SW620 a zvýšil podíl buněk pozitivních na annexin V v buněčných liniích SW620, HCT116, HepG2 a MBA-MD-231 (obr. 3k).3).3f–h), což naznačuje, že antiapoptotický účinek DARS-AS1 v rakovinných buňkách je opačný k funkci PACT indukující apoptózu.Dohromady tyto výsledky naznačují, že mechanismus onkogenní funkce DARS-AS1 může spočívat v inhibici funkce PACT.
Dále jsme prozkoumali funkční důsledky asociace DARS-AS1-PACT.Bylo hlášeno, že PACT aktivuje PKR prostřednictvím přímé interakce, která následně zvyšuje fosforylaci eIF2α, což způsobuje translační deleci a apoptózu17.Nejprve jsme zkoumali, zda DARS-AS1 ovlivňuje buněčnou lokalizaci PACT a PKR.Konfokální fluorescenční mikroskopie ukázala, že PACT a PKR byly vysoce kolokalizovány v buňkách SW620 s průměrným Pearsonovým korelačním koeficientem 0,72.Mezitím nadměrná exprese DARS-AS1 významně snížila PACT a PKR co-lokalizaci (průměrný Pearsonův korelační koeficient 0,61) (obrázek 4a).Abychom prozkoumali, zda DARS-AS1 může modulovat interakci PACT-PKR, provedli jsme koimunoprecipitační (co-IP) test s protilátkou anti-PACT v buněčných lyzátech SW620.PKR byla vysoce obohacena o anti-PACT v kontrolních buňkách, zatímco obnova PKR byla významně snížena v lyzátech z buněk nadměrně exprimujících DARS-AS1 (obr. 4b).Purifikované značené PACT a PKR byly použity pro in vitro proteinové vazebné testy.V souladu s tím ty, které poskytovaly DARS-AS1, ale žádnou kontrolní RNA, vykazovaly potlačenou interakci PACT-PKR (obrázek 4c).Všechny výsledky ukázaly, že DARS-AS1 narušil komunikaci PACT a PKR.
a pomocí konfokální fluorescenční mikroskopie byla pozorována společná lokalizace PACT a PKR v kontrolních buňkách nebo buňkách nadměrně exprimujících DARS-AS1.Jádra byla obarvena DAPI.Statistické výsledky byly získány ze 16 fotografií.b Koimunoprecipitace (co-IP) s použitím protilátky anti-PACT v buněčných lyzátech kontrolních buněk SW620 nebo buněk nadměrně exprimujících DARS-AS1.c Značené PACT, purifikované PKR a transkribované in vitro pomocí DARS-AS1 nebo falešné RNA byly inkubovány pro in vitro analýzu vazby proteinu.Pro imunoprecipitaci byly použity anti-flag protilátky.d Imunobloty s uvedenými protilátkami byly provedeny v buňkách SW620 a HCT116 transfekovaných kontrolní shRNA nebo DARS-AS1-shRNA s následným hladověním v séru.e Úrovně exprese DARS-AS1 změnily buněčnou citlivost na thapsigargin.Buňky SW620 byly transfekovány DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmidem nebo kontrolním plasmidem.Buňky byly ošetřeny thapsigarginem po dobu 48 hodin a životaschopnost buněk byla stanovena pomocí činidla MTS.f In vitro transkribovaný DARS-AS1 nebo slepá RNA a purifikovaný PACT byly použity pro in vitro aktivační test a detekci imunoblotem.g Imunobloty s použitím těchto protilátek byly provedeny na buňkách SW620-ctrl (vlevo) nebo buňkách nadměrně exprimujících mutanty PKR (vpravo).Tyto buňky byly poté transfekovány kontrolní shRNA nebo DARS-AS1-shRNA s následným hladověním v séru.h Průtoková cytometrie ukázala, že inaktivace mutantní PKR kompenzovala apoptózu indukovanou DARS-AS1 v buňkách SW620.i Imunobloty s uvedenými protilátkami byly provedeny v buňkách SW620 (vlevo) nebo HCT116 (vpravo).Buňky transfekované kontrolní shRNA nebo DARS-AS1 shRNA jsou zbaveny séra a doplněny 100 nM inhibitorem PKR C16 nebo DMSO.Měřítko = 5 um.Uvedená data jsou průměr ± standardní odchylka ze tří experimentů.* p ≤ 0,05 dvoustranný Studentův t-test.
Obecně se má za to, že jakmile PACT interaguje s PKR17, může být indukována PKR fosforylace na Thr451.Naše výsledky ukázaly, že hladina fosforylace PKR byla významně zvýšená v knockdown buňkách DARS-AS1 po hladovění v séru (obr. 4d a doplňkový obr. 4a).V souladu s tím jsme zjistili, že fosforylace eIF2α, hlavního substrátu PKR, byla také významně zvýšena DARS-AS1 shRNA (obr. 4d a doplňkový obr. 4a).Thapsigargin je ER stresor, který způsobuje, že ER uvolňuje Ca2+.Bylo popsáno, že léčba thapsigarginem indukuje expresi a aktivaci PACT, který dále interaguje a aktivuje PKR, což vede k apoptóze zvýšením fosforylace eIF2a18,61.Zde jsme použili thapsigargin jako stimulátor dráhy PACT/PKR, abychom prozkoumali, zda DARS-AS1 může pomoci buňkám překonat stres inhibicí dráhy PACT/PKR.Pozorovali jsme, že hladina exprese DARS-AS1 pozitivně korelovala s buněčnou rezistencí vůči thapsigarginu.Buňky SW620 nadměrně exprimující DARS-AS1 přežívaly lépe, když byly ošetřeny thapsigarginem, zatímco buňky s knockdownem DARS-AS1 se staly citlivějšími (obr. 4e).V souladu s těmito výsledky nadměrná exprese DARS-AS1 snížila fosforylaci PKR indukovanou thapsigarginem (doplňkový obrázek 4b).Naproti tomu po ošetření thapsigarginem byly PKR a eIF2a fosforylovány ve vyšší míře v knockdown buňkách DARS-AS1 ve srovnání s kontrolními buňkami (doplňkový obrázek 4b).Je zajímavé, že thapsigargin indukoval expresi DARS-AS1 způsobem závislým na dávce, což může naznačovat protistresovou funkci DARS-AS1 (doplňkový obrázek 4c).Kromě toho jsme provedli in vitro aktivační testy, abychom tato pozorování potvrdili.Stručně, PKR byla purifikována z buněčných lyzátů pomocí anti-PKR protilátky, poté inkubována s rekombinantním PACT a DARS-AS1 transkribovaným in vitro.Po enzymatické reakci byla pomocí WB detekována fosfo-PKR.Naše výsledky ukázaly, že fosforylace PKR byla významně inhibována DARS-AS1, ale ne kontrolní RNA (obrázek 4f).Tyto výsledky in vitro a in vivo naznačují, že DARS-AS1 inhibuje aktivaci PKR zprostředkovanou PACT.Současně jsme také pozorovali pokles obnovy PACT v přítomnosti DARS-AS1 (obrázek 4f).Tento výsledek je v souladu s výsledky in vitro proteinového vazebného testu (obrázek 4c) a opět ilustruje blokující funkci DARS-AS1 pro asociaci PACT-PKR.
Ser246 a Ser287 v doméně D3 PACT jsou vyžadovány pro aktivaci PKR při buněčném stresu.Substituce dvou serinových zbytků za alanin poskytla mutantní PACT (mutD), který aktivoval PKR v nepřítomnosti stresu, a substituce za alanin (mutA) obrátila protokol.Protože jsme prokázali důležitost této domény v přímé asociaci s DARS-AS1, vytvořili jsme tyto dva PACT mutanty, abychom otestovali, zda by tyto zbytky mohly být také zapojeny do interakce s DARS-AS1.Je zajímavé, že oba mutanti ztratili schopnost vázat se na DARS-AS1 (doplňkový obrázek 4d), což naznačuje, že pro účinnou interakci s DARS-AS1 může být vyžadována úplná struktura proteinu PACT.
Kromě toho naše výsledky také naznačují, že DARS-AS1-shRNA-indukovaná inhibice buněčné proliferace může být částečně obnovena nadměrnou expresí dominantního negativního mutantu PACT (PACTmutA) nebo dominantního negativního mutantu PKR (PKRmut) (doplňkový obrázek 4e.e).Nadměrná exprese dominantně negativních PKR mutantů snížila fosforylaci PKR indukovanou knockdownem DARS-AS1 stejně jako fosforylaci eIF2a v buňkách zbavených séra (obr. 4g).Ještě důležitější je, že podíl apoptotických buněk indukovaných knockdownem DARS-AS1 byl také snížen v buňkách nadměrně exprimujících PKRmut (obr. 4h a doplňkový obr. 4g).Inhibice aktivity PKR kinázy také zhoršuje funkci DARS-AS1, protože výsledky ukázaly, že knockdown DARS-AS1 zřídka spustil fosforylaci PKR a eIF2a, když byly buňky ošetřeny inhibitorem C16 specifickým pro PKR (obr. 4i a doplňkový obr. 4h).).Celkově vzato naše výsledky naznačují, že DARS-AS1 podporuje buněčnou proliferaci, alespoň částečně, inhibicí aktivace PKR zprostředkované PACT.
Abychom dále prozkoumali roli DARS-AS1 v tumorigenezi, provedli jsme in vivo experimenty s použitím myšího xenoštěpového modelu. Výsledky ukazují, že knockdown DARS-AS1 dramaticky snížil růst nádoru u myší (hodnota p < 0,0001) (obr. 5a). Výsledky ukazují, že knockdown DARS-AS1 dramaticky snížil růst nádoru u myší (hodnota p < 0,0001) (obr. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей) (мышей) (мышей) (мышей). Výsledky ukazují, že knockdown DARS-AS1 drasticky snižuje růst nádoru u myší (hodnota p < 0,0001) (obrázek 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001））(囀5a）)结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли опухоли у мыран001 Výsledky ukázaly, že knockdown DARS-AS1 významně snížil růst nádoru u myší (hodnota p < 0,0001) (obrázek 5a).Ve skupině s knockdownem DARS-AS1 tedy došlo k významnému poklesu průměrného objemu nádoru o přibližně 72,9 % a průměrné hmotnosti nádoru o přibližně 87,8 % (obrázek 5b-d).Tyto výsledky silně naznačují, že DARS-AS1 může významně podporovat růst nádoru in vivo.
Účinky knockdownu ad DARS-AS1 na kolorektální onkogenezi u nahých myší.Jsou ukázány růstové křivky (a), velikost nádoru (b), hmotnost (c) a snímky nádoru (d).Chybové úsečky představují ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, pomocí dvoustranného Studentova t testu. n = 10. ****p < 0,0001, pomocí dvoustranného Studentova t testu. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 dvoustranný Studentův t-test.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 za по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 dvoustranný Studentův t-test.Kaplan-Meier analyzoval korelaci mezi hladinami exprese DARS-AS1 a celkovým přežitím u pacientů s UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM a LGG.Vysoké hladiny exprese DARS-AS1 u pacientů byly v horních 50 %;nízká hladina exprese DARS-AS1 u pacientů byla v dolních 50 %.p-hodnoty byly stanoveny pomocí log rank testu.f Navrhovaný model, ve kterém DARS-AS1 reguluje dráhu PACT-PKR a růst nádoru.
Abychom lépe porozuměli klinickému dopadu DARS-AS1, zkoumali jsme korelaci mezi jeho expresí a přežitím pacientů.Analýzou souboru dat TCGA jsme zjistili, že vyšší exprese DARS-AS1 byla spojena s uveálním melanomem (UVM), renální chromofobií (KICH), renálním papilárním karcinomem (KIRP), mezoteliomem (MESO), multiplexem.Nižší přežití bylo významně spojeno s morfózou glioblastomu (GBM) a pacienty s nízkým stupněm mozkového gliomu (LGG) (obrázek 5e).Tyto výsledky naznačují, že DARS-AS1 může hrát důležitou roli v klinické progresi nádoru a může být potenciálním prediktivním biomarkerem u mnohočetných rakovin.
V této studii jsme pomocí rozsáhlého funkčního screeningu CRISPRi zjistili, že DARS-AS1 lncRNA překonává stres rakovinných buněk regulací dvou klíčových stresových respondérů, PACT a PKR.Přímou interakcí s PACT inhiboval DARS-AS1 aktivaci PKR zprostředkovanou PACT, čímž zabránil apoptotické buněčné smrti a podpořil buněčnou proliferaci (obr. 5f).Upregulace DARS-AS1 byla pozorována u různých typů rakoviny, což naznačuje, že její funkce podpory přežití rakovinných buněk za stresových podmínek může být široce použitelná na různé typy rakoviny.
PACT byl identifikován jako protein aktivátoru PKR a aktivace PKR zprostředkovaná PACT hraje důležitou roli při stresových reakcích regulací transkripce, translace, apoptózy a dalších důležitých buněčných procesů62.Po desetiletí byly činěny pokusy porozumět rakovinově specifické regulaci kaskády PACT-PKR.Zde naše studie odhalila odlišný mechanismus regulace PACT-PKR v rakovinných buňkách prostřednictvím buněčné lncRNA DARS-AS1, která se přímo váže na PACT, blokuje interakci PACT-PKR, inhibuje aktivaci PKR a fosforylaci eIF2α, čímž inhibuje stresem indukovanou apoptózu a stimulace případného proliferace rakoviny.buňky.Tento objev vrhá světlo na potenciální cíle lncRNA pro prognózu a terapii rakoviny.
Naše data ukázala, že knockdown DARS-AS1 senzibilizuje buňky na hladovění v séru s významným zvýšením fosforylovaných PKR a eIF2α.Tyto výsledky naznačují, že DARS-AS1 podporuje přežití rakovinných buněk v drsných podmínkách inhibicí aktivity PACT/PKR.Několik dalších nekódujících RNA, jako je ASPACT a nc886, se také účastní osy PACT/PKR downregulací mRNA PACT48 nebo regulací autofosforylace vazbou na PKR49,50,64.Mezi nimi DARS-AS1 působí jako disruptor asociace PACT-PKR.Tato studie obohacuje naše chápání regulace osy PACT/PKR a role lncRNA ve stresových reakcích.
PACT obsahuje tři samostatné domény.Každá z prvních dvou dsRBD je dostatečná k dosažení vysoké afinity vazby PACT k PKR, zatímco třetí doména (D3) je nutná pro aktivaci PKR in vitro a in vivo.Naše studie ukázala, že DARS-AS1 přednostně interaguje s doménou D3 (obr. 3h).Vzhledem k velké velikosti lncRNA (768 nukleotidů) může vazba DARS-AS1 na D3 fyzicky inhibovat interakci mezi doménou PACT dsRBD a PKR, a tím blokovat spojení PACT a PKR.Bodové mutace PACT, které nahradily Ser246 a Ser287 v D3 alaninem nebo aspartátem, narušily jeho vazebnou afinitu k DARS-AS1, což ukazuje na důležitost celkových strukturních a elektrických vlastností D3 v jejich asociaci.Další podrobnosti o tomto mechanismu budou vyžadovány v budoucnu s použitím přesnější biochemické analýzy a strukturní analýzy PACT s vysokým rozlišením.
Předchozí studie uvádějí, že DARS-AS1 podporuje buněčnou proliferaci prostřednictvím několika mechanismů51,52,53.V jednom příkladu výzkumníci pozorovali, že DARS-AS1 upreguloval svůj gen DARS kódující antisense protein cílením miP-194-5p v buňkách rakoviny ledvin.V této studii však knockdown DARS-AS1 měl malý vliv na transkripci DARS u různých typů rakoviny, včetně alespoň kolorektálního karcinomu, karcinomu prsu a jater.Protože lncRNA vykazují buněčně a tkáňově specifické expresní vzory, funkční mechanismy nemusí být zachovány napříč typy rakoviny, což může přispět k tomuto rozporu mezi našimi pozorováními a předchozími hodnoceními různých druhů rakoviny.K objasnění specifických mechanismů různých fyziologických a patologických procesů jsou zapotřebí speciální studie.
Analýza klinických dat ukázala, že exprese DARS-AS1 v nádorech nepřímo koreluje s přežitím pacientů s rakovinou, což podtrhuje důležitost osy DARS-AS1/PACT/PKR v prognóze rakoviny.Závěrem lze říci, že naše studie ukazuje, že DARS-AS1 je regulátorem signální osy PACT/PKR, podporuje proliferaci rakovinných buněk a inhibuje apoptózu během stresové reakce, což poskytuje další směr výzkumu a je v zájmu budoucího výzkumu potenciálních léčebných postupů. .
Lidské buněčné linie SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 a HEK293T byly získány od National Cell Line Resource Infrastructure v Číně.Všechny buňky byly udržovány v médiu DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) doplněném 10 % FBS (Gemini, Brooklyn, NY) a 1 % penicilin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) při 37 °C, 5 % CO2.inkubátor.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2a, Abcam (A0764));anti-eIF2a (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-p-tubulin, CST (2128);normální myší IgG, CST (5415S);normální králičí IgG, CST (2729S).Protilátky byly zředěny 1:1000 v PBST pro Western blot a 1:100 pro IP.
sgRNA byly vyvinuty pomocí veřejně dostupného nástroje nazvaného CRISPR-ERA66.Použili jsme výchozí parametry nástroje pro vývoj sgRNA a algoritmus vypočítal vazebná místa sgRNA v oblasti 3 kb.se středem v TSS.Soubory sgRNA oligonukleotidů byly syntetizovány v CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) a klonovány do humanizovaných pgRNA plazmidů (Addgene #44248).Celkem 12 ug spojeného humanizovaného plazmidu pgRNA, 7,2 ug psPAX2 (Addgene #12260) a 4,8 ug pMD2.G (Addgene #12259) bylo kotransfekováno do 5 x 106 HEK293T v 10 cm miskách DNA Refectaction Transfection články (CWBIO, Peking, Čína) podle pokynů výrobce.Supernatanty obsahující virus byly shromážděny 48 a 72 hodin po transfekci a přefiltrovány přes 0,45 um filtr.Pro screening byly buňky SW620 exprimující fúzní protein dCas9/KRAB získány virovou transdukcí.Modifikované buňky SW620 byly infikovány virovou knihovnou ve čtyřech nezávislých infekčních experimentech při MOI 0,1-0,3 a byly odebrány vzorky s 2 ug/ml puromycinu (Sigma, St. Louis, MO) po dobu 2 dnů.Poté byly buňky kultivovány po dobu 18 dnů in vitro s minimálním pokrytím knihovny 500 buněk/sgRNA pro screening.
Genomová DNA byla extrahována podle instrukcí QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Německo; 51183).Celkem bylo k vybudování knihovny použito 100 μg genomové DNA na biologickou repetici.Oblast sgRNA byla amplifikována dvěma cykly PCR a spojena s čárovým kódem.
Produkty PCR byly purifikovány pomocí gelu NucleoSpin® a PCR purifikační soupravy (MACHEREY-NAGEL, Düren, Německo; 740609.250) a kvantifikovány pomocí Qubit™ HS detekční soupravy pro dvouvláknovou DNA (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
K měření buněčné proliferace byl použit test MTS.Buňky byly nasazeny na 96-jamkové destičky v počáteční hustotě 2000 buněk/jamku.Relativní počet buněk byl měřen denně v uvedeném čase po dobu celkem 4-6 dnů.Pro každou jamku bylo 20 ul činidla MTS (Promega) zředěno 100 ul DMEM, inkubováno s buňkami po dobu 4 hodin při 37 °C a poté byla měřena OD490.
Schopnost neukotveného růstu byla objevena analýzou tvorby koulí.Stručně řečeno, 2000 buněk transfekovaných shRNA DARS-AS1 nebo kontrolní shRNA bylo kultivováno na mikrodestičkách s ultra nízkou přilnavostí (Corning) s výměnou média každé 4 dny.Sféroidy byly počítány po 14 dnech.Pro test zesílení bylo použito 500 buněk transfekovaných plazmidem s nadměrnou expresí DARS-AS1 nebo kontrolním plazmidem, jinak byl způsob nezměněn.
RNA byla transkribována pomocí T7 RNA polymerázy a biotin-16-UTP (Roche 1138908910) podle pokynů Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Zde použité primery jsou uvedeny v doplňkové tabulce 4.
Oblasti PACT nebo PKR kódující protein byly klonovány do pET15b (Addgene #73619) a transformovány do BL21(DE3).Bakterie byly přes noc inkubovány v LB s ampicilinem a poté 100krát zředěny čerstvým LB.Když OD600 média dosáhla 0,8, byl přidán 1 mM IPTG pro indukci exprese proteinu.Po inkubaci přes noc s mírným třepáním (250 otáček za minutu při 20 °C) se buněčná peleta shromáždila centrifugací (4000 otáček za minutu, 10 minut, 4 °C).Resuspendujte buněčnou peletu v lyzačním pufru (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) a inkubujte na ledu po dobu 30 minut, poté sonikujte (15 minut, 5 s zapnutí/vypnutí, na ledu) a odstřeďte (13 000 otáčky za minutu)., 30 min, 4 °С).Supernatant byl poté nanesen na pryskyřici Ni-NTA (QIAGEN) 3krát při 4 °C, promyt 4krát promývacím pufrem (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) a eluován 3krát, s celkovým 10 ml elučního pufru (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Purifikovaný protein byl stanoven pomocí WB a koncentrace byla stanovena pomocí soupravy pro stanovení proteinů Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP testy byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve, s modifikacemi.Stručně, 1x RIP pufr (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 % NP-40, inhibitor ribonukleázy RNasin (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteáza) lyžuje 1 cytostatický koktejl 1 x 1 x 1 cytostatikum (Roche, 1 mM DTT) a centrifugujte při 13 000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při 4 °C.Supernatant byl poté inkubován s magnetickými kuličkami proteinu A+G (Millipore) konjugovanými s 5 ug anti-PACT protilátky (Abeam) nebo IgG (CST).Kuličky byly 5krát promyty 5x RIP pufrem a poté štěpeny proteinázou K (NEB).RNA byla extrahována pomocí Trizol a stanovena pomocí RT-qPCR.Primery jsou uvedeny v doplňkové tabulce 5.
In vitro RIP test byl proveden podle modifikovaného standardního RIP testovacího protokolu.Celkem 5 pmol in vitro transkribované RNA bylo zředěno 1x RIP pufrem a tepelně hybridizováno inkubací při 65 °C po dobu 5 minut s následným pomalým ochlazením na teplotu místnosti.Z E. coli bylo purifikováno celkem 5 pmol intaktních nebo mutovaných flag-značených proteinů PACT.Inkubujte s renaturovanou RNA po dobu 2 hodin při 4 °C a postupujte podle výše uvedeného postupu pro analýzu RIP pro anti-flag IP.
Pro analýzu extenze RNA bylo 1x107 buněk lyžováno 1xRIP pufrem.Po centrifugaci při 13 000 ot./min po dobu 15 minut při 4 °C byl supernatant předem ošetřen 30 ul magnetických kuliček streptavidinu (Beckman) po dobu 2 hodin při 4 °C.Purifikovaný lyzát byl poté doplněn kvasinkovou tRNA a inkubován se 40 pmol renaturované RNA přes noc při 4 °C, poté další 2 hodiny a bylo přidáno 20 μl nových magnetických kuliček streptavidinu blokovaných BSA.Promývací krok sestával ze 4krát s 5x RIP pufrem a 4krát s 1x RIP pufrem.Odpovídající proteiny byly eluovány biotinovým elučním pufrem (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotin, PMSF) a separovány na NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Po barvení stříbrem (Beyotime Biotechnology) byly určité pásy vyříznuty a analyzovány MS.
Pro testování interakce mezi PACT a PKR byla provedena Co-IP analýza.Stručně, lyzáty supernatantu byly připraveny inkubací 1 x 107 lyžovaných buněk v 1 x RIP pufru s následnou centrifugací při 13 000 rpm po dobu 15 minut při 4 °C.Lyzáty byly naplněny magnetickými kuličkami protein A + G, konjugovány s 5 ug anti-PACT protilátky a jemně rotovány přes noc při 4 °C.Kuličky byly promyty 3x 5xRIP pufrem, dvakrát 1xRIP pufrem a eluovány 1xSDS pufrem.Získaný protein byl analyzován pomocí SDS-PAGE gelu a detekován pomocí WB.
Dva pmol označeného PACT a 1 pmol PKR byly purifikovány z E. coli.Zřeďte v 1× RIP pufru a inkubujte s 10 pmol renaturované RNA po dobu 2 hodin při 4 °C.Poté byly další dvě hodiny inkubovány s magnetickými kuličkami konjugovanými s proteinem A+G a anti-značenou protilátkou.Kuličky byly poté čtyřikrát promyty 1x RIP pufrem a eluovány 1x SDS pufrem.Výsledné PACT a PKR byly detekovány WB.